卵巢是哺乳动物产生配子（卵子）的场所,而卵泡的健康发育决定了动物的生殖潜能。研究表明所有的脊椎动物中都存在卵泡闭锁现象,绝大多数哺乳动物的卵巢中约有70%-99.9%的卵泡会在排卵前发生闭锁。卵泡闭锁过程十分复杂并且受到多种细胞因子调控。而非编码小RNAs（ncRNAs）就是其中之一,它们广泛参与体内细胞增殖、分化、凋亡,信号传导等多种生理调控过程,在各种组织、细胞活性或疾病发生过程中发挥重要作用。目前,卵泡闭锁过程中的ncRNA研究主要集中在miRNA领域,尤其是miRNA与卵泡颗粒细胞凋亡的关系。piRNA（piwi-interacting RNA）作为非编码RNA家族的年轻成员,正越来越受到关注。piRNA是与PIWI蛋白相作用的RNA,长度一般为24-32nt,能特异性地与PIWI蛋白相结合而发挥重要作用。目前还未见有关piRNA参与猪卵泡闭锁过程调控的报道,其在卵泡闭锁过程中的功能作用也尚不清楚。本文拟以猪卵泡和卵泡颗粒细胞作为研究对象,分析piRNA在猪卵泡闭锁过程中的表达特征及其对卵泡颗粒细胞凋亡的作用,并验证其通过相关靶基因对猪卵泡颗粒细胞凋亡的作用机制,为研究猪卵泡闭锁过程的潜在机制提供一种新的思路。本文主要研究内容及结果如下:1.猪卵泡闭锁过程中piRNA的差异表达分析首先挑选出健康和早期闭锁卵泡并对其分别进行小RNA的高通量测序,经过生物信息分析后筛选鉴定猪卵泡早期闭锁过程中的piRNA分子,采用三种工具筛选、鉴定不同闭锁程度卵泡中所表达的piRNA,分别在猪卵泡中共发掘出65278、67725、16027 个长度在 24-38bp 范围内的 piRNA。同时,采用 DESeq、DESeq2和edgeR三种方法进行差异表达分析,分别统计各算法所探测到的差异表达piRNA,结果在三种算法分别发现2414、633、296个差异表达的piRNA。三种算法结果发现共有103个piRNA在健康卵泡和早期闭锁卵泡中呈现差异表达,最终取交集得到12个差异表达的piRNA做后续试验验证分析。另外,我们对差异表达piRNA相关靶基因进行预测和生物学功能分析,主要包括GO富集分析和pathway富集分析,发现了与细胞凋亡和存活相关生物学过程,为后续试验验证分析提供了部分线索。上述结果表明piRNA在猪卵巢卵泡中大量表达,并且在卵泡闭锁的过程中具有潜在的作用及功能。2.特异性piRNA验证及其对猪卵泡颗粒细胞凋亡与增殖的影响利用qRT-PCR技术对健康和早期闭锁卵泡中差异表达的12个piRNA进行表达验证分析,结果显示,所验证piRNA分子表达趋势与高通量测序结果完全一致,其中 piR-23、piR-27、piR-64、piR-65、piR-76 差异显著。通过 FACS 进一步验证了差异显著的piRNA对颗粒细胞凋亡的影响,结果表明piR-23对颗粒细胞凋亡有显著影响。同时对piR-23进行了 RIP试验验证,充分证明piR-23是一个piRNA分子。另外,增殖试验表明piR-23对颗粒细胞增殖无显著影响。上述结果表明piR-23在卵泡闭锁过程中表达显著下调,并具有抗凋亡作用。3.piR-23的靶基因验证及其对猪卵泡颗粒细胞凋亡的影响首先从 NCBI（National Center for Biotechnology Information）获取猪的所有mRNA序列,利用短序列比对工具bowtie将piRNA序列比对到猪的所有mRNA序列,找到相应的所有靶基因。再通过生物信息分析,将GO富集分析和pathway富集分析所得相关凋亡基因共同分析,发现piR-23 的靶基因PTGS2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2）。利用 qRT-PCR 技术对健康和早期闭锁卵泡中PTGS2水平进行检测,结果表明PTGS2在卵泡闭锁过程中表达显著上调。通过FACS试验证实PTGS2在猪颗粒细胞中起到促凋亡作用。4.piR-23靶向PTGS2调控猪卵泡颗粒细胞凋亡通过qRT-PCR和Western blot试验技术证实piR-23可通过靶向结合PTGS2基因抑制其表达。FACS试验证实piR-23在猪颗粒细胞中起抑凋亡作用,通过靶向PTGS2降低猪颗粒细胞的凋亡率。上述结果表明piR-23靶向PTGS2调控猪颗粒细胞的凋亡。综上所述,本文研究结果表明piRNA在猪卵泡闭锁过程中特异性表达并调控猪颗粒细胞凋亡。在猪卵泡颗粒细胞中piR-23通过上调PTGS2表达来促进颗粒细胞的凋亡。