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目的:构建包含HBV POL-TP和HBC基因的原核表达重组质粒,转化至大肠杆菌诱导培养表达HBC和POL-TP重组蛋白。分别以两种重组蛋白为底物,通过噬菌体多肽文库筛选出能与重组蛋白HBC和POL-TP特异性结合的多肽,在HBV细胞模型中验证多肽在不同浓度作用下对HBV复制的调控作用,从中筛选出具有抗病毒作用的靶向多肽。方法:分析HBC(183aa)和HBV POL-TP(192 aa)的DNA序列并通过在线生物信息学软件进行稀有密码子优化后全序列人工合成。将合成后的HBC149 DNA和POL-TP DNA插入原核表达载体分别构建pET28a(+)/HBC149和pET28a(+)/POL-TP重组质粒。将两种重组质粒转化至大肠杆菌后进行自诱导培养,收获重组HBC149蛋白和重组POL-TP蛋白并进行纯化鉴定。重组HBC149和POL-TP蛋白作为底物与噬菌体多肽文库结合并淘选,除去结合力低的噬菌体,保留下结合力高的噬菌体,最后富集得到与靶蛋白特异结合力最高的噬菌体。对噬菌体的多肽展示区测序并按照测序结果合成一批备选多肽。将多肽按照不同浓度加入稳定表达HBV的肝癌细胞HepAD38进行模拟药物处理,通过细胞活性检测仪检测不同的多肽对HepAD38细胞增殖的作用。通过荧光定量PCR和Southern blot检测细胞裂解液中HBV复制中间体的表达水平。结果:(1)通过对pET28a(+)/POL-TP和pET28a(+)/HBC149质粒进行双酶切电泳,测序验证重组质粒构建正确;通过重组大肠杆菌的自诱导培养,破菌上清中含有大量重组HBC149蛋白和POL-TP蛋白,经SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定蛋白表达无误。(2)通过重组表达蛋白与噬菌体多肽库结合后进行三轮淘选最后富集得到与靶蛋白特异结合力最高的噬菌体(多肽)后测序合成,共获得8条多肽。(3)在HBV稳定表达的细胞系HepAD38内检测多肽对细胞增殖的影响:将多肽进行不同浓度稀释并作用于HepAD38,每隔24小时换液以确保多肽浓度在工作范围内。结果表明:在低浓度时,8条多肽对细胞增殖无明显作用,在较高浓度时有对细胞增殖存在一定作用。(4)通过荧光定量PCR和Southern blot检测多肽处理后的HepAD38中HBV复制中间体DNA的表达水平,结果表明TP-2,TP-3,TP-4,TP-5均具有一定的抑制作用,TP-8具有较明显的促进作用。结论:采取自诱导培养的方法,成功表达与HBV相关的可溶性的HBC和POL-TP重组蛋白,通过噬菌体多肽文库筛选获得一批与重组蛋白HBC或POL-TP蛋白特异性结合的多肽;在细胞水平筛选出3条对HBV复制具有抑制作用的多肽,同时筛选出1条对HBV复制具有促进作用的多肽。