论文部分内容阅读
喹赛多是新型喹噁啉类广谱抗菌促生长的动物专用药,其化学结构保留了喹噁啉-1,4-二氧化物母环,同时在其基础上对侧链进行改造,以降低毒性的同时保留其抗菌活性。本实验室现已从基础毒理、抗菌活性、基础代谢和抗菌促生长机理等各方面对喹赛多进行深入研究,以求证实其安全无毒,抗菌促生长的同时阐明其发挥作用的分子机制。2007年,朱慧玲研究了喹赛多对猪体内内分泌的影响,发现喹赛多可以在整体水平调节体内多种重要内分泌因子的表达,其中最值得关注的为生长激素(GH)的上调表达,然而其作用机制尚不清楚。为了阐明喹赛多影响GH合成和分泌的分子机制,本课题以大鼠垂体腺瘤细胞(GH3细胞)暴露于喹赛多为实验材料,运用Afrymetrix公司的GeneChip? Rat Gene1.0ST Array芯片和双向电泳—质谱联用技术,查找喹赛多作用于GH3细胞后差异表达的基因和蛋白,以求更加全面的了解喹赛多作用后GH3细胞内发生的变化。进而通过Gene Ontology, KEGG等进行功能富集分析,找到发挥作用的功能基因组和蛋白质组,综合分析基因组和蛋白组的结果,进而阐明喹赛多影响GH合成和分泌的分子机理。1.基因芯片和蛋白质组学时间和剂量的选择与确定为了探明喹赛多对GH3细胞中GH合成和分泌的影响,本研究采用RT-qPCR方法检测喹赛多(1-8μM)对GH3细胞作用0.5-24h后GH mRNA表达水平的变化。结果发现随着药物浓度的增大或作用时间延长,GH3细胞中GHmRNA的表达水平呈现出明显的量效关系。2μM喹赛多在短时间内(1h)对GH3细胞的GH mRNA表达水平有较明显的促进作用,可上调2.04倍。同时又通过ELISA试剂盒检测喹赛多(1-8μM)对GH3细胞作用0.5-24h后细胞上清中GH分泌量的变化,结果显示：喹赛多可以增加GH3细胞中GH的分泌量,且2gM喹赛多作用长时间(12h)可引起GH分泌量最大程度的上调,细胞上清中GH的分泌量较空白对照增加了20%。为了即时观测喹赛多引起GH mRRNA表达水平和GH分泌量上调最明显时刻GH3细胞中基因的变化情况,选取2μM的喹赛多孵育GH3细胞1h和12h这两个作用时间,进行基因芯片的检测。考虑到基因和蛋白质表达的不同步性,本研究中还采用BCA试剂盒检测了2gM喹赛多对GH3细胞内总蛋白含量的影响,结果表明从1h-12h,喹赛多对GH3细胞内蛋白的表达有促进作用,4h时促进作用最明显。结合ELISA方法检测GH分泌量的结果,因此选择2gM喹赛多孵育GH3细胞4h和12h这两个作用时间,进行双向电泳—质谱联用的检测。2.喹赛多作用于GH3细胞后差异表达的基因根据基因芯片的结果,通过药物处理组与空白对照组的对比,选取具有显著差异(p-value≤0.011、同时上下调倍数在1.5以上的基因进行分析。2gM喹赛多作用于GH3细胞1h的短时间组与空白组相比有15个差异基因,除2个基因下调表达外,其余13个基因均上调表达；2μM喹赛多作用于GH3细胞12h的长时间组与空白组相比有226个差异基因,其中205个基因的表达上调,21个基因的表达下调。将差异基因通过DAVID Bioinformatics Resources数据库进行GO功能富集分析,发现这些差异基因主要分为7类,包括：细胞内信号转导、核酸转录调控、离子转运、物质和能量代谢、细胞形态、细胞进程、免疫调节等。选取Egrl,Dusp8,Jun,Stat2,Prkar1b,Aldoc, S1c30a,Pik3ipl等基因进行RT-qPCR验证,RT-qPCR得到的数据与基因结果一致,说明基因芯片结果可靠。3.喹赛多作用于GH3细胞后差异表达的蛋白采用双向电泳(2-DE)和飞行时间串联质谱(MALDI-TOF/TOF-MS)技术分析发现,与空白组相比,喹赛多作用于GH3细胞后共鉴定分析出37个差异蛋白质,其中2μM喹赛多作用于GH3细胞4h组有23个差异蛋白,2μM喹赛多作用于GH3细胞12h组有26个差异蛋白,两组同时出现的蛋白有12个。通过功能分类,发现这些蛋白主要包括分子伴侣、细胞转运蛋白、蛋白激酶因子、维持细胞形态相关蛋白、细胞内物质和能量代谢相关蛋白。综合分析基因组和蛋白质组学的结果,发现喹赛多可能通过上调G蛋白偶联受体,第二信使cAMP及其反应原件CREB,从转录水平上上调GH mRNA的表达；第二,BIP蛋白,PDI, Ppia, Rab蛋白和Cacn可能为喹赛多影响GH蛋白分子合成的分子靶点。BIP蛋白,PDI和Ppia等蛋白对于内质网和高尔基体内GH糖基化和二硫键的形成相关。同时喹赛多作用于GH3细胞后开启了钙离子通道,这对于GH与膜的融合至关重要,而且对于内质网,高尔基体和线粒体形态的维持和功能发挥也有重要影响。Rab GTPase作为分子开关,通过影响GTP的活性调节膜融合,喹赛多可以上调Rab9b,Rabl4b, Rab l8影响GDP/GTP转换；而且喹赛多可以通过直接上调糖酵解,磷酸戊糖途径,和三羧酸循环中的相关酶类醛缩酶(Aldolase),烯醇酶(Eno2),磷酸葡糖脱氢酶(Pgd),3-磷酸甘油醛脱氢酶(APDH),异柠檬酸脱氢酶(IDH),ATP依赖性柠檬酸裂合酶(Acly)影响GH3细胞内物质和能量代谢,改善GH3细胞的能量供给,为GH的合成和释放提供更加有利的条件。