论文部分内容阅读
目的:在改良ALLEN法建立的大鼠脊髓损伤动物模型上,检测芸香苷是否能促进脊髓损伤后大鼠的神经功能恢复,改善脊髓损伤后炎症因子浸润,减轻炎症反应,并检测芸香苷对脊髓损伤后PI3K/AKT信号通路的影响,来探讨芸香苷发挥脊髓损伤后神经保护作用的作用机制。方法:1.动物模型和分组:120只雄性成年SD大鼠,随机分成4组,每组30只。假手术组(CON组):切除椎板,不损伤脊髓,注射1ml的DMSO;脊髓损伤组(SCI组):根据ALLEN法建立脊髓损伤大鼠模型(T10节段),注射1ml的DMSO;甲强龙治疗组(MP组):脊髓损伤同SCI组,腹腔内注射甲强龙30mg/kg;芸香苷治疗组(RT100组):脊髓损伤SCI组,腹腔内注射芸香苷100mg/kg。2.每组10只大鼠,在脊髓损伤后的第1、2、3周,采用体感诱发电位对大鼠脊髓功能进行客观检测,观察指标选用潜伏期和波幅。在脊髓损伤后的第1、7、14、21、28天,采用BBB评分、斜坡实验和改良Tarlov评分等行为学方法评价大鼠后肢运动功能和身体平衡能力。3.取材:在大鼠脊髓损伤后24小时处死动物,每组5只大鼠取新鲜脊髓用于含水量检测;每组5只大鼠取新鲜脊髓用于ELISA、明胶酶谱法和光谱分析法;每组5只大鼠取新鲜脊髓用Western Blot实验;每组5只大鼠经心脏灌注4%多聚甲醛内固定后取脊髓,放在相同固定液再固定24小时后,石蜡包埋切片用于免疫组织化学染色和HE染色。4.采用免疫组化染色法测定脊髓组织中IL-1β、TNF-α、MCP-1、IL-10、TGF-β、GFAP、IBA-1、Bax、Bcl-2的表达,采用HE染色观察脊髓组织形态和病理表现。5.采用Hsu公式测定脊髓损伤后脊髓组织含水量,采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定脊髓组织中MIP-2的含量,明胶酶谱法测定脊髓组织中MMP-9的含量,光谱分析法测定IKKβ激酶活性。6.采用Western blot法检测脊髓组织中的P-AKT、NF-κB P65、Bax、Bcl-2的表达。结果:1.体感诱发电位结果:SCI组在第1、2、3周的SEP潜伏期与CON组比较明显延长,SEP的波幅均明显下降;与SCI组相比,MP组和RT100组在第1、2、3周潜伏期均呈现不同程度的缩短,波幅均呈现不同程度的升高,差异有统计学意义(p<0.05)。2.BBB、斜坡实验、改良Tarlov功能评分的结果:在脊髓损伤后的每个检测时间点,SCI组大鼠的评分均明显低于CON组;与SCI组相比,MP组和RT100组大鼠的评分虽然在第1和第7天无明显差异,但在第14、21、28天均明显提高,差异有统计学意义(p<0.05)。3.脊髓含水量的结果:与CON组相比,SCI组的含水量明显升高,差异有统计学意义(p<0.05);与SCI组相比,RT100组脊髓含水量明显降低,差异有统计学意义(p<0.01);MP组和RT100组相比,治疗效果相当,在脊髓组织含水量上没有差异,无统计学意义(p>0.05)。4.HE染色结果:与CON组相比,SCI组中的神经元细胞数量明显减少,差异有统计学意义(p<0.05);与SCI组相比,MP组和RT100组神经元细胞数目减少受到抑制,差异有统计学意义(p<0.05);MP组和RT100组相比,在抑制神经元数目减少方面,效果相当,没有统计学意义(p>0.05)。5.免疫组化染色炎症因子表达的结果:与CON组相比,SCI组中的IL-1β、TNF-α、MCP-1水平显著升高,差异有统计学意义(p<0.05);与SCI组相比,RT100组和MP组IL-1β、TNF-α、MCP-1表达水平明显降低,差异有统计学意义(p<0.05);与CON组相比,SCI组中的IL-10、TGF-β水平明显升高,差异有统计学意义(p<0.05);与SCI组相比,RT100组和MP组中IL-10、TGF-β表达水平明显增高,差异有统计学意义(p<0.05)。6.ELISA检测MIP-2含量的结果:与CON组相比,SCI组中MIP-2的水平明显增强,差异有统计学意义(p<0.05);与SCI组相比,MP组和RT100组中MIP-2水平明显降低,差异有统计学意义(p<0.05,p<0.01);MP组和RT100组中MIP-2表达水平没有明显差异(p>0.05)。7.明胶酶谱法测定MMP-9活性的结果:SCI组和CON组相比,MMP-9的活性和生成量都明显升高,差异有统计学意义(p<0.05);与SCI组相比,MP组和RT100组中MMP-9的生成量和活性明显降低,差异有统计学意义(p<0.01);MP组和RT100组相比,脊髓组织中MMP-9的活性和生成量没有差异,无统计学意义(p>0.05)。8.免疫组化染色检测GFAP和IBA-1表达的结果:SCI组与CON组相比,GFAP、IBA-1表达水平明显增高,差异有统计学意义(p<0.05);与SCI组相比,RT100组和MP组GFAP和IBA-1表达降低,差异有统计学意义(p<0.05)。9.光谱分析检测IKKβ激酶活性结果:在CON组中,脊髓组织的IKKβ激酶活性较低,SCI组相比CON组中IKKβ激酶活性明显增高,差异有统计学意义(p<0.05);MP组和RT100组IKKβ激酶活性相比SCI组明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);MP组和RT100组相比在抑制IKKβ激酶活性上差异无统计学意义(P>0.05)。10.免疫组化染色和Western blot检测Bax和Bcl-2表达的结果:SCI组与CON组相比,Bax表达水平明显增高,而Bcl-2表达明显降低,差异有统计学意义(p<0.05);与SCI组相比,RT100组和MP组Bax的表达降低,Bcl-2的表达升高,差异有统计学意义(p<0.05);RT100组和MP组相比,差异没有统计学意义(p>0.05)。11.Western blot p-Akt和NF-κB P65表达的结果:CON组中p-Akt、NF-κB P65蛋白的表达较少,SCI组和CON组相比,p-Akt、NF-κB P65蛋白表达明显增高,差异有统计学意义(p<0.05);与SCI组相比,药物治疗组在p-Akt、NF-κB P65蛋白的生成量上都有不同程度的抑制作用,RT100组和MP组能够调节p-Akt、NF-κB P65蛋白的表达,差异有统计学意义(p<0.05);MP组和RT100组在表达p-Akt、NF-κB P65蛋白方面无显著差异,没有统计学意义(p>0.05)。结论:1.芸香苷能够缩短脊髓损伤大鼠SEP潜伏期,增加波幅,改善脊髓损伤后大鼠的后肢运动能力和身体平衡能力,对脊髓损伤后大鼠的神经功能有保护作用。2.芸香苷能够减轻脊髓损伤后的组织水肿,减少神经元细胞的损伤,抑制促炎因子IL-1β和TNF-α的表达,减少趋化因子MCP-1、MIP-2和MMP-9的产生,促进抗炎因子IL-10和TGF-β因子的表达,抑制星形胶质细胞和小胶质细胞的激活,减轻炎症反应。3.芸香苷能够抑制脊髓损伤后PI3K/AKT信号通路,降低IKKβ激酶活性,减少p-Akt和NF-κB P65蛋白的表达,下调Bax的表达,上调Bcl-2的表达,降低Bax/Bcl-2的比例,抑制细胞凋亡。芸香苷可能是通过PI3K/AKT实现对脊髓损伤大鼠的神经保护作用。