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同种异体骨软骨(osteochondral allograft,OCA)移植适用于治疗大面积软骨损伤,其主要步骤包括供体关节的获取、保存、受体区准备、移植物钻取、准备和植入,应用8~35mm直径的圆柱形骨软骨(osteochondral cylinder,OCC)或贝壳形(shell)骨软骨片治疗对应尺寸的软骨损伤。同种异体骨软骨植入前常以脉冲方式清洗软骨下骨以清除残留供体骨髓组织减轻术后免疫反应。动物实验研究中,降低OCA术后免疫反应水平可以促进骨融合并延缓关节退行性变已被证实。OCA术后,软骨下骨通过爬行替代或一期愈合的方式,从供、受体骨性组织边缘及底部交界面开始,与宿主骨组织逐渐融合。清除软骨下骨内残留组织可能有利于减少术后骨愈合和重塑时间,有利于术后早期康复。然而,OCA术中软骨下骨内骨髓清除的效果及其影响因素并不明确。同种异体骨移植中,骨髓组织清除效果的分析通常基于定量分析清洗前后骨髓腔内脂肪组织含量的变化,而其他骨髓内容物如造血组织等的清除效果分析、评价方法并不完善。应用计算机断层扫描(computed tomography,CT)技术测量骨水泥在髓腔清洗后的松质骨表面穿透深度可间接分析和比较骨髓清除结果。显微CT(micro-computed tomography,μCT)技术及造影剂的应用,可以在三维空间(3 dimensions,3D)区分、定位骨、脂肪、液体等不同密度组织。结合传统骨及骨髓成分组织学2D分析技术,显微CT可能能够应用于OCA软骨下骨内骨髓组织清除效果的分析评价。目的本研究目的是建立以显微CT为主的软骨下骨内显微空间结构定性、定量分析技术,对(1)不同清洗时长;(2)不同清洗流速;(3)术前不同保存方式,以及(4)软骨下骨显微结构对临床常见OCA骨髓组织清除效果的影响进行对比分析研究。方法实验一:38枚圆柱形骨软骨样本(-80℃/保存1~3年,30枚;4℃/保存3天,8枚,直径8mm,软骨下骨厚6mm)采集于34例膝关节骨性关节炎(osteoarthritis,OA)患者(男17例,女17例,平均年龄68±10岁)全膝关节置换术(total knee replacement,TKR)中切取的股骨髁片。20枚相同大小样本采集于6例股骨髁OCA供体关节(均为男性,平均年龄30±7岁)。样品置于自制限制性脉冲清洗系统以正常或高流速清洗0~120秒(冷冻(-80℃)TKR组)或15和120秒(新鲜(4°C)TKR或OCA供体关节组)。冷冻TKR清洗0秒组为阴性对照组,3%过氧化氢、70%乙醇超声清洗冷冻TKR组(n=2)作为阳性对照组。实验二:16枚大直径圆柱形骨软骨片样本(-80℃/保存1~3年,8枚;4℃/保存3天,8枚,直径20mm,软骨下骨中央厚3~5mm)采集于16例OA患者(男6例,女10例,平均年龄64±12岁)TKR股骨髁片。4枚相同大小样本采集于4例股骨髁OCA供体关节组织(全为男性,平均年龄30±7岁)。样本以临床常用方式以正常或高流速清洗45秒后,再次清洗总计120秒。软骨下骨内髓腔空间的定性定量分析:样本脉冲清洗前后采用造影剂20%海塞显(Hexabrix)显微CT扫描,而后三维配准各次扫描图像以建立软骨下骨内相同位置、体积感兴趣区(volume of interest,VOI)。VOI内骨髓、骨组织灰度值分布曲线以高斯拟合(Gaussian Fitting)函数和最小二乘法(Least Square)计算骨髓体积(marrow volume,Ma.V)和骨体积(bone volume,BV)。以Otsu算法以自适应阈值分离骨组织图像后,计算骨体积百分比(bone volume fraction,BV/TV),和平均骨小梁间隙宽度(trabacular separation,Tb.Sp)。在分离移除骨组织图像后,以高斯函数拟合游离Hexabrix溶液灰度值分布曲线的方式计算脉冲清洗前后软骨下骨内空白骨髓空间百分比(empty marrow volume fraction,EMa.V/Ma.V)。实验一中,显微CT扫描后,采用样本大体外相和组织冰冻切片油红O和苏木精染色定性、定位分析清洗前后软骨下骨内残余骨髓组织。统计学分析:采用单因素或双因素方差分析、协方差分析,及事后Tukey检验进行数据处理和分析。p<0.05认为有统计学意义。结果:实验一:定性分析显示骨软骨骨髓清除效果随清洗时间延长而增长。大体外相中,随着清洗时间的延长,黄色的软骨下骨由底部开始逐渐褪色至灰白色,而配准后的冰冻切片和显微CT图像共同定位显示了软骨下骨小梁间残余骨髓组织。显微CT图像的定量分析亦证实了8mm直径骨软骨样本EMa.V/Ma.V与清洗时长的相关性(p<0.001),冷冻TKR组清洗120秒后EMa.V/Ma.V可达73%。新鲜TKR组和OCA组正常流速清洗15或120秒EMa.V/Ma.V均较冷冻TKR组低(p<0.05),但新鲜TKR组(15秒后达21%,120秒后达36%)和OCA组(15秒后达24%,120秒后达40%)无显著性差异(p=0.91-0.99)。同时,OCA组EMa.V/Ma.V在15或120秒均与清洗流速正相关(p<0.05),并受协变量软骨下骨Tb.Sp(p<0.05)和BV/TV(p<0.05)影响。尽管OCA组EMa.V/Ma.V未显示出清洗时间依赖性(p=0.47),其骨髓清除效果仍然有随时间延长而增长的趋势。实验二:显微CT图像的定量分析证实了20mm直径骨软骨片样本同样存在EMa.V/Ma.V与清洗时长(p<0.001),冷冻保存(p<0.001)和清洗流速(p<0.05)相关性。然而,以OCA术中正常流速脉冲清洗120秒,新鲜骨软骨样本的骨髓清除率仅达55%。结论:显微CT联合应用造影剂(Hexabrix)能够定性、定量分析软骨下骨三维空间显微结构和骨髓清除效果。OCA术中骨髓清除效果较低,受骨组织空间结构影响,并随清洗时间的延长、清洗流速的提升、以及术前冷冻保存而增高。术前传统临床保存方式(4°C)对骨软骨移植术中骨髓清除效果没有影响,术前移植物的冰冻保存(-80°C)有助于提高术中骨髓清除率。同时,膝关节置换术获取的关节骨软骨组织具有与OCA组织相似的软骨下骨内骨髓清除效果,存在潜在的临床应用价值与前景。