论文部分内容阅读
第一部分;热休克蛋白27（HSP27）在单纯乳腺增生、不典型增生及乳腺癌中的表达及其意义目的采用半定量逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术检测并比较HSP27mRNA在单纯乳腺增生、不典型乳腺增生两种具有不同恶变风险的乳腺病变及乳腺癌中的表达,探讨HSP27在乳腺组织恶性转化过程中的作用,并分析其表达水平与乳腺癌各病理指标间的关系。方法收集2004.12-2005.06期间在齐鲁医院诊治的68例乳腺癌患者的癌组织及癌旁正常组织标本,并记录术后病理诊断中肿瘤大小、淋巴结转移数目和ER、PR、Her2的表达情况;同时收集同期内15例乳腺不典型增生组织、27例单纯乳腺增生组织。应用RT-PCR技术检测上述标本中HSP27 mRNA的表达,在凝胶成像系统下分析电泳条带,HSP27表达的相对值=HSP27条带光密度值/β-actin条带光密度值,半定量分析HSP27 mRNA在单纯乳腺增生、不典型增生、乳腺癌及配对的癌旁组织中的表达情况。结果HSP27 mRNA在单纯乳腺增生组织、不典型增生组织、乳腺癌组织中的表达分别为0.251±0.032、0.611±0.038、0.589±0.041,HSP27 mRNA在乳腺癌和不典型增生中的表达明显高于单纯乳腺增生（P＜0.05）,但从不典型增生至乳腺癌的过程中HSP27的表达无明显变化（P=0.86）;癌旁正常组织中HSP27 mRNA的表达为0.377±0.023,明显低于乳腺癌组织（P=0.04）,却高于单纯乳腺增生组织,但差异不具统计学意义（P=0.42）。在乳腺癌中,HSP27 mRNA的表达与肿瘤大小、病理类型、组织学分级、PR状态、Her2状态、腋窝淋巴结状况无关,与ER表达呈正相关（相关系数rs=0.764,P＜0.001）。结论不典型增生和乳腺癌中HSP27的表达明显增强,乳腺癌中HSP27的表达与ER显著相关,提示HSP27的过度表达在乳腺癌形成的早期就存在,并可能在部分乳腺癌,尤其是ER阳性乳腺癌的发生、发展过程中起促进作用,HSP27可为探讨乳腺癌发生机制、高危病例筛选提供一种新的途径,可能成为乳腺癌预防和治疗中新的靶点。第二部分;热休克蛋白27真核表达载体的构建与鉴定目的构建重组人HSP27真核表达载体,并检测其在MDA-MB-231细胞中的表达,为研究HSP27在乳腺组织恶性转化过程中的作用及其对乳腺癌生物学行为的影响做准备。方法从高表达HSP27的人乳腺癌细胞MCF-7中提取总RNA,RT-PCR法反转录合成cDNA。设计扩增产物含有HSP27基因CDS序列的一对引物（上游引物;5′AAGCTTCTGAGCAGACGTCCAGAGCA-3′,下划线部分为HindⅢ酶切位点;下游引物;5′GGATCCGCATCCGGGCTAAGGCTTT-3′,下划线部分为BamHⅠ酶切位点）,调取目的基因片段,与T载体连接后转化大肠杆菌DH-5α,筛选菌落并抽提质粒。测序正确后,双酶切克隆进入真核表达载体pCDNA3.1/myc-His（+）A中,得到重组质粒pCDNA3.1-HSP27。用此重组真核表达载体转染低表达HSP27的人乳腺癌细胞MDA-MB-231,采用RT-PCR和Western blot技术分别从mRNA和蛋白水平鉴定重组质粒在细胞中的表达。结果用设计的引物成功的扩增出679bp的两端分别带有HindⅢ和BamHⅠ酶切位点的HSP27片段,与理论值相符。测序结果与Genbank（NM001540）提供的人HSP27基因CDS序列完全符合。琼脂糖凝胶电泳显示经HindⅢ和BamHⅠ双酶切后,重组质粒pCDNA3.1-HSP27被切为5.5Kb和679bp两个片段,5.5Kb的片段符合pCDNA3.1/myc-His（+）A酶切后的大小,679bp符合插入的HSP27基因片段大小。RT-PCR和Western blot检测表明,与未转染细胞相比,重组质粒pCDNA3.1-HSP27转染的MDA-MB-231细胞中HSP27的表达在mRNA和蛋白水平均明显增强。结论含人HSP27全长CDS序列的pCDNA3.1-HSP27真核表达载体构建成功,并在MDA-MA-231细胞中获得高效表达,为进一步研究HSP27在乳腺癌发生、发展中的作用奠定了基础。第三部分;热休克蛋白27对乳腺上皮细胞HBL—100和乳腺癌细胞MDA-MB-231生物学特性的影响目的用携带有HSP27基因的真核表达载体pCDNA3.1-HSP27分别转染低水平表达内源性HSP27的人正常乳腺上皮细胞系HBL—100和人乳腺癌细胞系MDA-MB-231,观察和分析上调HSP27表达对两种细胞的形态、增殖活性、DNA倍体的影响,比较MDA-MB-231细胞的粘附、侵袭和迁移能力在转染前后的变化,探讨HSP27对乳腺癌发生、发展的促进作用及其机制。方法采用阳离子脂质体法将携带有人HSP27基因CDS序列的真核表达载体pCDNA3.1-HSP27分别转染入人乳腺上皮细胞系HBL—100和人乳腺癌细胞系MDA-MB-231内,以空载体质粒pCDNA3.1/myc-His（+）A转染的细胞和未接受转染的细胞为对照,G418筛选阳性克隆;采用RT-PCR和Western-blot技术检测转染组、空载体组和未转染组细胞中HSP27 mRNA和蛋白的表达。分别应用倒置相差显微镜、MTT法和流式细胞技术,观察和检测转染前后细胞大体形态的变化、细胞增殖活性的改变、细胞周期及DNA倍体的变化;RT-PCR法检测cyclinD1、p21CIP1/WAF1和p27KIP1的表达。同时采用MTT法检测转染、空载体和未转染三组MDA-MB-231细胞与细胞外基质的粘附能力,Transwell小室法检测其侵袭和转移能力,流式细胞术分析CD44v6,MMP-9和TXMP-1的表达。结果成功筛选出稳定转染pCDNA3.1-HSP27质粒的HBL-100和MDA-MB-231细胞,转染组HBL-100和MDA-MB-231细胞中HSP27蛋白的水平分别是未转染组的2.7和3.5倍。与空载体组和未转染组相比,转染组HBL-100和MDA-MB-231细胞的大体形态均未发生明显改变;转染组HBL-100细胞的增殖活性、SPF值和DI值均明显高于空载体组和未转染组（P＜0.05）,转染组HBL-100细胞的p27KIP1显著降低（P＜0.05）;在MDA-MB-231细胞,三组的增殖活性无明显差异;转染后MDA-MB-231细胞的DI值明显高于空载体组和未转染组,粘附和侵袭能力明显增强,而迁移能力下降;转染后MDA-MB-231细胞中CD44v6和MMP9的表达显著增强,而TIMP1的水平明显降低。结论稳定转染pCDNA3.1-HSP27质粒的HBL-100和MDA-MB-231细胞内HSP27的mRNA和蛋白表达水平均明显升高。HSP27能降低HBL-100中p27KIP1的表达,从而促进细胞增殖并提高其S期细胞比例,同时能够提高细胞DNA含量,这可能是HSP27促进正常乳腺上皮细胞恶性转化的机制;HSP27能够降低MDA-MB-231细胞的迁移能力,但它同时能够提高细胞DNA含量,并通过促进细胞中CD44v6和MMP9的表达,降低TIMP1的水平,提高细胞的异质型粘附和侵袭能力,这可能是HSP27促进乳腺癌发展的分子机制。第四部分;热休克蛋白27对乳腺癌细胞化疗敏感性影响的实验研究目的高表达HSP27的乳腺癌细胞能对包括阿霉素在内的一些化疗药物产生耐药,目前尚无HSP27是否影响紫杉醇抗癌作用的研究,并且据报道紫杉醇能够抑制子宫内膜癌和卵巢癌细胞中HSP27的表达。本实验旨在研究HSP27高表达能否诱导乳腺癌细胞对紫杉醇产生耐药,紫杉醇能否抑制乳腺癌细胞中HSP27的表达,确定更有效的紫杉醇联合阿霉素的使用方法。方法以内源性高表达HSP27的人乳腺癌细胞系MDA-MB-435、MCF-7和内源性低表达HSP27的人乳腺癌细胞系MDA-MB-231为研究对象。采用MTT技术检测分析阿霉素、紫杉醇、阿霉素→紫杉醇序贯和紫杉醇→阿霉素序贯治疗对具有不同HSP27表达水平的乳腺癌细胞的肿瘤抑制作用,流式细胞术分析药物处理后肿瘤细胞的凋亡情况;并应用Western-blot方法分析化疗药物处理前后细胞中HSP27、TopoⅡα、TopoⅡβ表达的变化情况。结果紫杉醇在三种细胞中的IC50值无明显差异,而阿霉素在MDA-MB-231中IC50值明显低于其在MCF-7和MDA-MB-435中的IC50值。在三种细胞中,阿霉素→紫杉醇和紫杉醇→阿霉素两种序贯治疗都有明显的肿瘤抑制作用;药物联合作用效应分析显示,无论是何种顺序联合二者间都存在协同作用。但对MCF-7和MDA-MB-435来说,紫杉醇→阿霉素的抑制作用强于阿霉素→紫杉醇（P＜0.05）,紫杉醇→阿霉素的协同作用较阿霉素→紫杉醇也更明显,特别是当紫杉醇和阿霉素的浓度≥0.1μmol/L时;但在MDA-MB-231中没有发现这种差异。凋亡分析显示,与阿霉素→紫杉醇序贯使用相比,紫杉醇→阿霉素序贯治疗能诱导更多的MCF-7和MDA-MB-435细胞发生凋亡（P＜0.05）。Western-blot结果显示紫杉醇能够抑制MCF-7和MDA-MB-435细胞中HSP27的表达,上调阿霉素作用靶点TopoⅡα和TopoⅡβ的表达,这可能是在HSP27过度表达的乳腺癌细胞中,紫杉醇→阿霉素序贯治疗更为有效的原因。结论HSP27不能诱导乳腺癌细胞对紫杉醇产生耐药;紫杉醇能够抑制乳腺癌细胞中HSP27的表达,并提高TopoⅡ的表达;在HSP27高表达的乳腺癌细胞中,紫杉醇→阿霉素序贯联合治疗较阿霉素→紫杉醇顺序治疗更有效,为伴有HSP27高表达的乳腺癌患者化疗方案的选择提供了实验依据。