论文部分内容阅读
背景胃癌的早期诊断是改善其预后的关键。呼出气挥发性有机化合物(VOCs)作为一种新型的简单、无创的诊断方法受到越来越多的关注。我们前期研究表明呼出气VOCs在胃癌早期诊断中具有潜在的应用价值,但其生成机制尚不清楚。大多数观点推测VOCs的产生与癌细胞的氧化应激反应有关。呼气VOCs的形成与肿瘤异常代谢相关,而代谢产物的产生又与机体转录调控紧密联系。考虑到呼气VOCs与唾液代谢物都是基因异常代谢的产物,两者存在共同之处。我们拟通过胃癌癌组织转录组学高通量测序分析和胃癌唾液非靶向代谢组学研究整合分析,为胃癌呼气VOCs的生成机制研究提供线索。目的建立基于胃癌癌组织的转录组学高通量分析方法和基于超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱(UHPLC-QTOFMS)技术的胃癌唾液非靶向代谢组学分析方法,多组学整合分析以寻找代谢产物涉及的氧化应激相关基因,为胃癌呼气VOCs的生成机制研究提供线索。方法收集100例原发性胃癌患者术后癌组织及相应30例癌旁正常组织标本,进行c DNA文库构建及质检合格后,利用高通量测序平台对文库进行双端测序。以q(多重假设检验校正的p值)小于0.05,基因差异倍数(foldchange)的绝对值大于2作为标准筛选显著性DEGs。将q<0.05作为显著性富集标准,对DEGs采用KOBAS3.0软件进行KEGG通路富集分析。进一步收集148例胃癌患者、30例良性胃病患者和26例健康人唾液样本,代谢物提取后,采用UHPLC-QTOFMS技术进行非靶向代谢组学分析。原始数据经预处理后,以学生t检验p值<0.1,同时正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)模型第一主成分的变量投影重要度(VIP)>1为卡值标准,筛选出各组间差异化合物,然后经二级质谱匹配及正、负离子组组合去重复处理得到明确匹配的差异代谢物。对差异代谢物采用Metabo Analyst4.0在线工具进行代谢通路分析。最后将转录组学与代谢组学数据整合分析,找出代谢组学显著富集通路中涉及的DEGs,并采用DAVID6.8软件对其进行GO功能富集分析,筛选出与氧化应激相关的基因。结果转录组学分析,发现5845个显著性DEGs,其中3661个基因明显上调,2184个基因明显下调。KEGG富集分析发现蛋白质消化吸收,细胞因子-细胞因子受体相互作用,矿物质吸收,胰腺分泌,药物代谢-细胞色素P450等29条显著富集通路。唾液代谢组学研究显示,正、负离子模式下分别保留3637和2538个色谱峰,其中癌症唾液(CS)与良性唾液(BS)组差异化合物分别为631和859个,CS与正常唾液(NS)组差异化合物分别为427和567个,BS与NS组差异化合物分别为170和453个。进一步二级质谱匹配及正、负离子组组合分析后,在CS和BS组,CS和NS组及BS和NS组分别得到112,31和45个明确匹配差异代谢物。代谢通路分析发现精氨酸和脯氨酸代谢,氨酰基-t RNA生物合成,氮代谢,嘧啶代谢等14条代谢通路在CS和BS组及CS和NS组均富集。多组学整合分析,共得到97个与代谢组学显著富集通路相关的DEGs,进一步GO分析,在氧化还原生物学过程中发现19个基因与氧化应激相关,其中12个(GLDC、ALDH3B2、NOS3、PRODH、AOC1、NOS2、PRODH2、RRM2、P4HA3、IL4I1、PIPOX、PAH)明显上调,7个明显(ALDH4A1、MAOA、PHGDH、ALDH6A1、TXNRD2、SARDH、ALDH3A1)下调。结论通过多组学整合分析,我们发现多个与呼气VOCs产生相关的潜在候选基因,为胃癌呼气VOCs的产生机制研究提供了线索。但尚需进一步的呼气实验来探明其具体机制。