子宫颈癌(cervical cancer)是危害广大妇女健康最常见的恶性肿瘤之一,研究表明,宫颈癌的发生多为由癌前病变发展为原位癌、浸润癌的渐进性过程。寻求一个预测宫颈癌的增殖、侵袭、转移等恶性潜能的有效指标,对于指导宫颈癌的治疗、改善预后有重要的临床意义。Crk是近年来研究发现一种重要的细胞内信号接头蛋白,为原癌基因c-Crk的表达产物,参与了细胞内受体整合蛋白和酪氨酸激酶等多种网络信号分子的信号转导。在正常情况下,Crk在胚胎和成人多数的组织中无表达或少量表达,但在人类乳腺癌、肺癌、卵巢癌、恶性胶质瘤等多种恶性肿瘤组织中Crk呈过度表达,且表达水平与肿瘤细胞的转移、侵袭和增殖相关。在宫颈癌中信号接头蛋白Crk的研究在国内外未见报道。为了解信号接头蛋白Crk在宫颈癌中的的表达情况及其在宫颈癌的发生发展过程中的作用,我们用免疫组化SP法对宫颈癌,宫颈上皮内瘤样病变(cervical intraepithelial neoplasias,CIN),正常宫颈组织进行了Crk蛋白的半定量检测和比较,探讨Crk在宫颈癌发生发展过程中的作用及作为反映宫颈癌恶性潜能指标的价值。结果显示,在宫颈CIN病变阶段Crk蛋白的表达即开始明显增高,在宫颈癌组织中呈过度表达,并且随着宫颈癌病理分级的降低和淋巴结转移,Crk蛋白的表达水平逐渐增高,提示Crk与宫颈癌前病变及宫颈癌的发展有密切关系。为了明确宫颈癌中过度表达的Crk与宫颈癌恶性潜能的关系,我们在细胞水平对Crk做了进一步的研究。RNA干扰(RNA interfering, RNAi)是一种转录后基因沉默(Post-transcriptional gene silence,PTGS)的基因阻断技术,近年来被广泛应用于哺乳动物细胞抑制目的基因的表达。在本研究中,我们利用RNAi技术,使用载体pSUPER构建的重组质粒pSUPER-Crki,以脂质体转染入高表达Crk的人宫颈癌Caski细胞株,显著抑制了Crk mRNA的转录和蛋白的表达,建立了稳定阻抑Crk基因表达的Caski细胞株。通过绘制细胞生长曲线、软琼脂克隆形成实验、Transwell小室体外侵袭实验、细胞骨架荧光染色等方法,检测Caski细胞生物学行为的变化。结果显示,Crk siRNA处理后的细胞生长速度减慢、软琼脂克隆形成率下降、穿过人工基底膜的细胞数减少(p﹤0.05),细胞的黏着斑形成减少,细胞骨架染色也明显弱于以上两种对照组细胞。说明信号接头蛋白Crk可能通过参与癌细胞的黏着斑的组装和细胞骨架的重组,在癌细胞的黏附、侵袭和迁徙过程中发挥作用。本实验证实了过度表达的接头蛋白Crk在宫颈癌的发生发展中有促进作用,参与宫颈癌Caski细胞的增殖、侵袭、迁徙等恶性生物学行为。RNAi技术可以有效抑制了宫颈癌Caski细胞株中Crk基因的过度表达,阻断Crk蛋白介导的细胞信号转导途径,从而有效阻抑了Caski细胞的恶性潜能。Crk有望成为新的宫颈癌基因治疗的分子靶点。第一部分信号接头蛋白Crk在子宫颈癌组织中的表达和意义目的:研究信号接头蛋白Crk在宫颈癌及其癌前病变组织中的表达,探讨Crk在宫颈癌发生发展中的作用。方法:采用免疫组化SP法检测20例正常宫颈组织、27例CIN和50例宫颈癌切片中Crk蛋白的表达水平。结果:Crk蛋白在宫颈癌组织中的阳性表达率为68%,高于CIN的40.7%和正常宫颈组织的10%,差异有统计学意义(p﹤0.05)。结论:Crk可能在宫颈癌的生长、浸润及转移过程中起重要作用,有望作为反映宫颈癌恶性潜能的新指标。第二部分Crk siRNA真核表达质粒对宫颈癌Caski细胞Crk基因表达的抑制目的:观察重组质粒pSUPER-Crki转染Caski细胞后的Crk基因的表达抑制率,建立稳定阻抑Crk基因表达的Caski细胞株。方法:将Crk特异性的RNA干扰质粒pSUPER-Crki由脂质体介导转染入Caski细胞,将Caski细胞分为3组:(1)Crk-RNAi组:转染入pSUPER-Crki质粒,有效沉默Crk基因的表达,建立稳定转染Crk siRNA的细胞株;(2)空载体组:转染入pSUPER的空载体质粒的稳定转染细胞株;(3)空白对照组:不转染质粒。用RT-PCR和Western blot检测各组细胞转染质粒前后Crk mRNA和蛋白表达水平的变化。结果:Western blot检测证实Caski细胞中存在着高表达的Crk蛋白;转染PSUPER-Crki质粒后能明显抑制Caski细胞内源性Crk mRNA和蛋白的表达,Crk mRNA水平下降74.8 %,蛋白水平下降72.4 %。结论:以Crk基因为靶向的RNAi可有效抑制Caski细胞中的Crk基因的表达。第三部分RNA干扰沉默Crk基因对Caski细胞生物学行为的影响目的:RNA干扰沉默宫颈癌Caski细胞株的Crk基因表达后,观察能否有效阻抑宫颈癌Caski细胞株的增殖、侵袭、转移等恶性潜能。方法:用细胞生长曲线、软琼脂克隆形成实验、Transwell小室体外侵袭实验、细胞骨架荧光染色等方法,检测各实验组细胞生物学行为的变化。结果:Crk-RNAi组与空白对照组及空载体组比较,细胞生长速度减慢、软琼脂克隆形成率下降、穿过人工基底膜的细胞数减少(p﹤0.05),其细胞的黏着斑减少,骨架染色也明显弱于以上两种对照组细胞。结论:信号接头蛋白Crk可能参与宫颈癌Caski细胞的黏着斑的组装和细胞骨架的重组,促使癌细胞增殖、侵袭、转移等恶性潜能。