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研究背景肺癌是发病率和死亡率最高的恶性肿瘤,严重危害我国人民的健康。肺癌按照病理学类型可以分成两大类:其中约80%-85%为非小细胞肺癌（non-small-cell lung cancer,NSCLC）,另外 15%-20%为小细胞肺癌（small-cell lung cancer,SCLC）。尽管在手术、化学治疗、放射治疗和靶向治疗方面取得了巨大的进步,但晚期肺癌的5年生存率仍较低,不到5%。免疫治疗,特别是免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors,ICIs）,有望改善这一临床问题。ICIs已被批准用于晚期肺癌的治疗。但由于肿瘤的异质性及肿瘤微环境的复杂性,免疫单药在非选择患者中有效率偏低。大型临床研究显示在不加选择的人群当中,免疫治疗在肺癌患者中仅有20%左右的有效率。免疫细胞是肿瘤微环境中重要的组成部分之一,研究非小细胞肺癌免疫特征将有助于进一步发展免疫治疗。此外,当前晚期NSCLC（尤其是肺腺癌）驱动基因的发现已为该类患者的治疗带来了革命性变化,靶向表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）驱动基因的治疗显著改善了这类患者的预后,治疗后其中位总生存时间（overall survival,OS）可达30月。但是至今已经明确的驱动基因在肺腺癌患者中只占到70-75%的比例,仍然有一部分肺腺癌患者的驱动基因处在未知状态。本文将以非小细胞肺癌免疫特征出发,并基于此,聚焦NSCLC基因突变患者免疫特征,探索EGFR突变对NSCLC免疫微环境的影响。本研究共分三部分进行:第一部分非小细胞肺癌免疫检查点图谱特征目的:对NSCLC患者样本的免疫检查点进行免疫组织化学染色分析,通过分析免疫标志物的表达与生存状况,帮助预测肺癌患者疾病进展及指导临床用药更加精准,NSCLC患者的免疫联合治疗提供参考。研究方法:对139例NSCLC患者的以下免疫检查点进行免疫组织化学染色分析,包括:程序性死亡蛋白1（programmed cell death protein 1,PD-1）、程序性死亡配体1（programmed death ligand 1,PD-L1）、淋巴细胞活化基因 3（lymphocyte activating gene 3,LAG-3/CD223）、T 细胞免疫球蛋白粘蛋白-3（T cell immunoglobulin and mucin-domain containing-3,TIM-3）、半乳糖凝集素-9（Galectin-9,GAL-9）、主要组织相容性复合物 Ⅱ（major histocompatibility complex Class Ⅱ,MHC Ⅱ）、OX40/OX40L。结果:在P值阈值为0.05时,OX40在TILs上的表达与吸烟状态（P=0.028）、病理类型和TILs占比显著相关。此外,病理类型与TILs（P=0.031）和肿瘤组织中MHC-Ⅱ的表达（P=0.0.02）显著相关。同样,肺癌分期与OX40L在肿瘤细胞上的表达（P=0.012）,PD-L1 在 TILs 的表达（P=0.037）,MHC-Ⅱ 在 TILs 上的表达相关。肿瘤组织中GAL-9是唯一与分级有显著相关性的IC（P=0.037）。然而,临床病理因素与OX40、PD-L1、GAL-9、TIM-3、TIM-3在TILs中的表达无显著相关性。ICs并不相互排斥,大多数患者（82.0%）有1-6个阳性ICs,只有7名（5.0%）患者没有ICs表达。患者通常同时表达OX40与OX40-L的高表达,这提示了联合应用这两种靶向药物对患者有很大的益处。OX40L在肿瘤上的表达（p=0.027）,GAL-9在肿瘤上的表达（p=0.039）,LAG-3在TIL上的表达（p=0.039）,MHC-Ⅱ在TIL上的表达（p=0.014）,TIM-3在肿瘤上的表达（p=0.004）,TIM-3在TIL上的表达（p=0.034）,性别（p=0.011）,肺癌分期（p＜0.001）,分级（p=0.041）,转移（p＜0.001）分别显示与OS显著相关。另外,OX40在肿瘤上的表达（p=0.097＜0.1）,MHC-Ⅱ在肿瘤上的表达（p=0.083＜0.1）,病理学（p=0.052＜0.1）也被认为是OS的潜在预后因素。TIM-3在肿瘤细胞或TIL中的阳性和阴性状态与中位生存时间显著相关。特别是,TIM-3阴性肿瘤细胞患者的总体生存期显著延长（OS 2.790年,95%CI 1.800-3.780 vs.0.090 年,95%CI 0.000-0.760,P=0.004）。值得注意的是,TIL-3 阴性与 TIM-3 阳性患者的 OS 有显著差异（OS 2.960 年,95%CI 为 2.268-3.652,vs.1.080 年,95%CI为 0.228-1.932,P=0.034）。另外,在 TILs 上 OX40L 阳性的 NSCLC 患者中 OS 比OX40L阴性的 NSCLC 患者延长（OS 1.080 年,95%CI 0.301-1.859,vs.3.040 年,95%CI 2.317-3.763,P=0.027）。通过以上分析,我们将单因素P＜0.1的变量进一步纳入多因素分析,明确了 GAL-9在肿瘤上的表达（P=0.041）,LAG-3在TILs上的表达（P=0.005）,MHC-Ⅱ在TILs上的表达（P=0.024）,以及TIM-3在肿瘤上的表达（P=0.001）均与OS显著相关。我们尝试对RFS的不同免疫因子及临床特点也进行了进一步总结。GAL-9在TIL上的表达（p=0.036）、LAG-3在TIL上的表达（p=0.025）、MHC-Ⅱ在TIL上的表达（p=0.028）、TIM-3 在肿瘤中的表达（p=0.019）、TIM-3 在 TILs 上的表达（p=0.048）、肺癌分期（p＜0.001）、分级（p=0.049）和转移（p＜0.001）,均分别显示与OS显著相关。此外,OX40在肿瘤上的表达（p=0.075＜0.1）、OX40L在肿瘤上的表达（p=0.066＜0.1）、OX40L 在 TIL 上的表达（p=0.077＜0.1）、PD-L1 在肿瘤上的表达（p=0.054＜0.1）、GAL-9在肿瘤上的表达（p=0.083＜0.1）、性别（p=0.084）和病理学（p=0.087＜0.1）也被认为是RFS的潜在预后因素。通过以上分析,我们将单因素P＜0.1的变量进一步纳入多因素分析,明确了OX40在肿瘤上的表达（P=0.045）,OX40L在TILs上的表达（P=0.034）,GAL-9在TILs上的表达（P=0.023）和TIM-3在肿瘤上的表达（P=0.002）均与RFS显著相关。结论:当前,对非小细胞肺癌的精确分类强调了准确的分型指导原则。免疫治疗在肺癌患者中取得了良好的效果,迫切需要生物标志物来准确地对肺癌进行分类和监测其疗效。通过研究综述了非小细胞肺癌TILs和肿瘤细胞上ICs的14种表达,并分析了不同ICs之间的相关性以及ICs与预后的相关性。今后,将继续探索更多靶点在不同病理类型肿瘤中的作用,为免疫联合治疗提供更精确的理论支持。第二部分非小细胞肺癌免疫微环境单细胞特征目的:非小细胞肺癌（NSCLC）约占肺癌病例的85%,其主要亚型为肺腺癌（LUAD）和肺鳞状细胞癌（LUSC）。LUAD和LUSC肿瘤具有不同的组织学特征和体细胞突变特征,对治疗的反应也不同。为了更全面地了解不同亚型NSCLC的细胞网络和基因表达模式,我们采用大规模平行单细胞RNA测序方法对13例LUAD和15例LUSC患者手术切除的NSCLC肿瘤进行分析。研究方法:采用单细胞测序方法对13例LUAD和15例LUSC患者的手术切除标本,共79917个单细胞进行测序,并在单细胞水平上对癌细胞和免疫细胞进行基因表达谱分析。进一步分析了富含不同NSCLC亚型的信号通路,比较了不同EGFR表达的LUAD以及LUSC肿瘤细胞之间的异质性。结果:将所有肿瘤分为三组:LUSC,野生型EGFR的LUAD和突变型EGFR的LUAD。通过单细胞测序分别检测三组肿瘤微环境中的细胞组成,分析各组分在组中所占比例的异同。其中,所有具有EGFR突变的LUAD显示明显的单细胞多样性。在EGFR突变的LUAD中,免疫细胞浸润,特别是淋巴细胞浸润非常低。这可能导致了 EGFR突变的LUAD患者对基于ICIs的免疫疗法的反应相对更差。LUAD EGFR野生型肿瘤细胞B细胞和内皮细胞的比例明显高于其他LUSC及突变型LUAD患者（P＜0.05）,而LUSC中髓细胞的比例明显低于两组（P=0.00082）。结论:通过单细胞测序,我们发现了肺腺癌与肺鳞癌免疫微环境的区别;并且发现EGFR突变与不突变的腺癌患者的免疫微环境也有差别。这提示我们是否能从免疫微环境的差别中探索EGFR突变患者免疫治疗疗效不佳的难题。从LUAD和邻近组织中采集到的肿瘤和基质细胞的综合数据集也将推动肺癌诊断和治疗的进展。第三部分EGFR突变对非小细胞肺癌免疫微环境的影响目的:目前,免疫检查点抑制剂（ICIs）已广泛应用于非小细胞肺癌（NSCLC）的治疗。然而,抗PD-1/PD-L1单克隆抗体（anti-PD-1/PD-L1）治疗EGFR突变肺腺癌（LUAD）的疗效并不理想,其确切机制尚未完全阐明。由于肿瘤突变负荷（TMB）和肿瘤免疫表型被认为是ICIs疗效的潜在预测因子,我们进一步研究了 LUAD患者的TMB和免疫表型,以探索EGFR阳性突变患者ICIs疗效不佳的潜在机制,寻找可能影响肿瘤免疫表型的因素,从而为临床提供新的治疗策略或联合治疗方案。研究方法:我们从2013年12月至2014年12月在上海市肺科医院接受手术或活检的患者中收集了 223个福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织块,并回顾了他们的病历。根据国际肺癌研究协会（IASLC）第7版TNM分期系统确定疾病分期。没有病人在手术或活检前接受过化疗、靶向治疗或免疫治疗。通过EGFR突变状态与ALK重排检测,靶向区域测序,TMB评估,免疫组化和免疫表型分类进行统计分析。结果:患者的中位年龄为61岁（28至83岁）。有吸烟史者168例（75.3%）。其中82.7%的患者从未吸烟。多为Ⅰ期（71.5%）,1例为微侵袭性腺癌。半数以上的患者（52.0%）有EGFR突变,只有9.0%的患者发生ALK重排。约83.4%的LUAD患者存在RTK/RAS/RAF信号通路突变。最常见的突变基因是EGFR（48.4%）,其次是KRAS（9.2%）、ERBB2（4.6%）、MET（3.5%）、FGFR3（2.5%）和 MAP2K1（2.1%）。在我们的队列中,其他基因的突变频率相对较低。在我们的患者队列中,我们没有发现TMB水平与病理分期、肿瘤大小、转移状态之间的关联。我们还评估了 TMB水平是否与PD-L1在肿瘤细胞上的表达相关,且未检测到显著相关性（OR=0.707,95%CI 0.083-6.060,p=0.752）。根据EGFR突变情况将患者分为两组,发现116例（52.0%）患者有EGFR突变。分别分析了两组的突变,并比较了两组不同基因的突变频率后,发现显著差异突变的基因是 KRAS（3.45%vs.20.56%,p=0.0002）和 BRCA2（3.45%vs.12.15%,p=0.0299）。在不同TMB水平和EGFR突变状态的患者中,三种免疫表型的比例相似。同时,我们没有发现ALK重排与免疫表型相关（p=0.714）。然而,我们发现在不同的M期（p=0.007）和不同PD-L1表达水平（p=0.018）的患者之间,免疫表型比例存在统计学差异。我们还分析了 EGFR突变与调节性T细胞（Treg）浸润的相关性,但没有发现显著差异。然后我们比较了三组之间的突变基因。炎症、中间型和非炎症患者的ALK突变频率分别为6.67%、1.41%和0%（p=0.0254）。CDKN2A突变频率在中间型免疫表型中最高,其次是炎性表型（3.33%对7.04%对0%,p=0.0154）。IDH2的突变频率在三种表型中也有显著差异（6.67%vs2.82%vs0%,p=0.0467）。我们还发现MAP2K1 突变（6.67%vs.4.23%vs.0%,p=0.0435）和 PTEN 突变（20%vs.8.45%vs.5.13%,p=0.0429）的患者比例不同。结论:我们将重点放在治疗初期的LUAD患者上,以避免治疗对肿瘤突变状态和免疫表型的影响,我们发现EGFR突变患者的TMB水平较低,而有吸烟史的患者TMB水平较高。此外,在EGFR野生型患者中,KRAS和BRCA2的突变频率显著增高。这些结果可以解释为什么EGFR突变的患者ICIs预后差。我们还发现不同免疫表型的ALK、IDH2、CDKN2A、MAP2K1和PTEN的突变频率不同。这些基因在LUAD肿瘤免疫微环境中的作用,是否可以作为调节肿瘤免疫的靶点或联合治疗的靶点,还有待于进一步的研究。