抗髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG-Abs）抗体（MOG-Abs）最初在急性播散性脑脊髓炎（ADEM）患儿中有报道。进一步研究发现成人和儿童患有ADEM、癫痫、脑炎、抗水通道蛋白-4抗体（AQP4-Ab）-血清阴性的视神经脊髓炎（NMOSD）和相关综合征（视神经炎、脊髓炎和脑干脑炎）的MOG-Abs,是近30年前首次通过免疫印迹和酶联免疫吸附试验检测到的,但它们与多发性硬化（MS）的关系并不明确。使用以天然MOG为底物的细胞分析法,能够鉴定一组具有脱髓鞘表型的MOG-Ab阳性患者。对于多发性硬化（multiple sclerosis,MS）神经免疫医学科学家们的解释为:一类源于中枢神经系统（central nervous system,CNS）的高发性自身免疫性病变,此类疾病发病率的高低可能与地理纬度高低及赤道的远近存在某种特殊的比例关系。多发性硬化发生发展的根本原因是免疫调节异常。由于诊断MS敏感性和特异性高的生物学标记物一直未能找到,因此该病的早期明确诊断和早期有效治疗十分困难。目前认为,不明类型的病毒感染、各种类型的自身免疫性炎症、某些不正常的环境因素和特殊遗传因素是诱导MS的主要病因。MS的病变通常集中在脑干、视神经、大脑半球的两侧侧脑室旁以及颈胸腰脊髓传导束等位置,此病灶存在血管附近多发性局灶性炎性介质浸润、少突胶质细胞变性增殖、不可逆性轴索受损、CNS内髓鞘程度不等的脱失等病理学改变。MS多在20-40岁青壮年之间好发,女性与男性的发病之比为2:1,此病临床表现如下:神经脑脊髓病灶在时间上的多发性和在空间上的多发性。世界神经病学领域目前统一认可的实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE）的经典模型为:经相应神经髓鞘抗原构建的可较为客观地仿效MS的病理特点与临床表现的动物模型,在全球探讨MS的病机与病因、开展临床治疗方面,此动物模型具备高度适用性。这些年,在对疾病的认知程度逐渐提升背景下,已有报道证实维生素D（Vitamin D receptor,VD）与VD受体（Vitamin D receptor,VDR）直接参与了 MS致病过程,对患者补充维生素D或维生素D类似物病情可以部分缓解,但基本不能从根本上治疗。现今还没有找到MS/EAE确切的发病机制。具备有效性的临床疗法也未出现,对此类病人生活品质质量产生极大威胁,所以我们将从microRNA角度探讨VDR与MS/EAE的关系,对于治疗与预防MS中新靶点的寻找,给予积极指导。1.研究目的（1）对通过选择髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（myelin oligodendrocyte glycoprotein,MOG,中国上海生肽有限公司）为抗原,与体内抗原异常识别,模仿人体的抗原抗体反应,顺利制备的EAE小鼠模型所发生的免疫反应的产生与MS患者相同临床行为学指标与相应病理学改变展开相关检测;（2）研究VDR在EAE小鼠模型中T13-L2脊髓前角表达变化;（3）研究帕立骨化醇（Paricalcitol,PC,Sigma Aldrich公司,USA）治疗前后EAE小鼠的行为学变化;（4）研究在EAE小鼠模型中以VDR为靶点的microRNA的表达;（5）探讨在EAE小鼠模型T13-L2脊髓前角中miR-125a-5p与VDR相互调控的过程及其机制。2.实验方法:（1）实验分组:将动物中心购买的符合实验标准实验动物为60只雌性C57BL/6小鼠,最低周龄不小于8周,最大周龄不超过为10周;为了便于对比,减少误差,小鼠的体重不宜相差太大,处于18g至20 g上下为最佳范围。经随机方式将实验动物分别归入CON组（即CON组,control,对照组）;Vehicle组（即皮下注射CFA+PBS,complete Freund’s adjuvant+phosphate buffered saline,溶媒组）;EAE 组（皮下注射MOG35-55抗原,实验组）;PC组[该组治疗为经腹腔注入帕立骨化醇（Paricalcitol）];EAE+antagomir miRNA-125a-5p 组（即鞘内注射 miR-125a-5p 的拮抗剂给药组）;EAE+NC antagomir组（接受鞘内注射NC antagomir治疗,为拮抗剂阴性对照给药组）,各组小鼠均为10只（简要流程如图1）。（2）建立EAE模型:用8mg MOG 35-55多肽抗原加在4ml CFA,乳化的最终浓度2mg/mL,加入装有4mg/mL的结核分枝杆菌试剂瓶中混合均匀,将小鼠皮下注射到四个不同侧翼部位。在MOG注射后1小时,准确量取0.1 mL的百日咳毒素（PTX,pertussis toxin,300 ng/0.1 mL,Sigma,USA）混合PBS（磷酸盐缓冲盐水）充分溶解混匀,再经腹腔注入体内。免疫48小时后再次腹腔内注射相同剂量的PTX。（3）分别对未免疫前与免疫后空白对照组、溶媒组及免疫组实验动物每天同一时间段进行行为学测评与神经机能两项重要指标评估,免疫当天开始计算为第1天,自小鼠免疫后第1天开始,由两名观察者于每日9点测量一次小鼠的体重,并详细记录小鼠的每天的精神状况、饮食水量、所有的行为特征以及发病情况,由两名经培训且熟练的观察者严格遵循传统的双人双盲原则,用目前一致认可的国际通用五分法（具体如下）,对空白对照组、溶媒组及免疫组实验小鼠进行临床神经功能评分。（4）PC组自免疫当天起每只小鼠每日腹腔注射帕立骨化醇（按1ug/kg给药）,CON组和EAE组小鼠均每天同时腹腔内注射0.1mL帕立骨化醇,直至处死。（5）生物信息学分析:运用 Target ScanMouse 7.1、miRTar.Human and genome-wide Target基因预测软件预测所有靶基因及靶基因所涉及的信号通路。（6）EAE+miRNA-125a-5pantagomir 组,每日每只 EAE 小鼠鞘内注射 10uL miR-125a-5pantagomir（200nmol）的拮抗剂,检测EAE小鼠的体重和神经功能评分,直到处死。（7）EAE+NC antagomir组,即鞘内注射antagomir NC组,每日每只EAE小鼠鞘内注射 10 uL antagomir NC（200 nmol）的拮抗剂。（8）HE染色法,对各组小鼠予以冰生理盐水灌注,接着用冰多聚甲醛（4%）对新鲜脊髓腰膨大组织实施固定,等到成功完成固定,制备为石蜡切片,接受HE染色处理,检测炎性细胞浸润等病理改变。（9）运用RT-PCR和Western Blot方法于免疫后第21天,分别检测脊髓中VDR、miR-125a-5p、miR-125b-5p、miR-351-5p的表达水平和VDR的蛋白表达变化。（10）运用免疫荧光化学方法检测VDR在小鼠腰膨大脊髓前角神经元内的表达分布。（12）所有结果均用mean±SEM表示。分析前,检验全部数据的正态性。当统计只涉及两个平均值时,使用双尾双样本t检验。当涉及多个比较时,首先进行ANOVA或Friedman ANOVA。如果原假设检验的总体p值（alpha值）为p＜0.05,则采用Dunn后续检验对不同组进行后续比较。在均值不符合正态分布时,接着接受Mann-Whitney检验。将p＜0.05界定为结果存在显著差异的标准。对实验数据统计,使用Prism（Version 8,GraphPad-Prism,San Diego,CA,USA）软件开展多组对比分析。3.实验结果:（1）以C57BL/6小鼠为对象,由MOG 35-55、PTX与CFA均可以有效制备出EAE模型,于免疫后第7d～第9d范围内可观察到同MS运动症状相似的若干现象出现,待至第21d,发病发展至峰值。（2）经过PC治疗,可使EAE小鼠的临床表现有效逆转。CON组实验动物没有发现异常症状出现,无毛发脱落,摄取食水如常,无运动障碍。由免疫诱导途径制备的EAE组小鼠,表现为较高发病率,从免疫后第7d起,体重开始朝减轻下发展,第九天较明显,反应迟缓、皮毛不光滑、食欲不振、部分吞咽困难、运动逐渐减少、尾巴无力等神经系统损害症状。通过比较各组小鼠每天的临床评分和体重评分及其他行为学改变发现,自第9天开始,帕立骨化醇组（PC组）小鼠的行为学改变较EAE组小鼠明显改善（P＜0.01）。（3）小鼠腰骶膨大（T13-L2）组织HE染色示:CON组实验动物HE结果正常。免疫后第21天,EAE组发病峰值时相应的脊髓切片能够观察到弥漫性炎性介质浸润,一些损伤极为明显者能够观察到“血管袖套”样变化;通过对对照组和实验组HE染色病理评分比较结果显示统计学存在明显差异（P＜0.001）。（4）免疫荧光染色显示:VDR在小鼠腰膨大脊髓Neu N中表达。（5）鞘内注射miR-125a-5p（antagomir）能有效提高EAE组小鼠的体重并且改善临床症状。予以Antagomir NC鞘内注射EAE组,临床症状及体重无明显改变。通过对比后miR-125a-5p（antagomir）组和Antagomir NC组中小鼠每天测定的临床神经功能评分均数发现,自PC开始治疗后第9天开始,miR-125a-5p antagomir组小鼠的临床神经功能评分与antagomir-NC组小鼠相比较,其分值逐渐降低,统计结果为P＜0.05,即存在显著差别。（6）EAE组免疫印迹法结果发现VDR蛋白表达降低,RT-qPCR方法检测发现VDR降低、miR-125a-5p的表达升高;与EAE+antagomir NC组相比较,鞘内注射miR-125a-5p（antagomir）的 EAE 组（即 EAE+miR-125a-5pantagomir）VDR 蛋白表达升高,VDR mRNA升高、miR-125a-5p miRNA的表达下降。对照组EAE 比较,EAE+NC组VDR蛋白表达无变化,VDR的mRNA、miR-125a-5p的miRNA无统计学意义。4.实验结论:（1）以C57BL/6小鼠为对象,通过MOG35-55、CFA与PTX能够有效制备出EAE模型;（2）VDR参与EAE的免疫调节,PC能够使EAE的临床表现发生逆转;（3）MiR-125a-5p在EAE的小鼠模型脊髓中表达明显升高;通过使miR-125a-5p表达下调,能够增强VDR表达,由此使EAE小鼠临床表现得以改善,说明miR-125a-5p通过调控VDR参与了 EAE的发病。这为系统深入研究VDR及miR-125a-5p的相互作用机制、预防及治疗EAE/MS,实现了诊断标志物以及治疗思路的创新。