论文部分内容阅读
研究目的： 随着女性社会生活的角色越来越重要，以及环境污染等因素，乳腺癌已经成为中国城市女性第一位的高发疾病（2017年国家癌症中心报告）。近年来对乳腺癌的临床及科研，乳腺癌可以得到更好的早期发现，在治疗上除了手术切除，还包括了放疗、化疗以及内分泌治疗，尤其是利用HER-2阳性的曲妥珠单抗靶向治疗，提高了患者的生存率。但是由于肿瘤的异质性和个体的特异性，上述的治疗方法，并未能解决一些复杂的疾病，而耐药也是亟待解决的问题。因此，基于精准治疗的目标，研究新型有效的靶向治疗方法迫在眉睫。 MicroRNAs(miRNAs)是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长约20～25个核苷酸。通过与靶标mRNA的3非编码区(3UTRs)的互补作用位点相结合，直接降解靶mRNA或抑制mRNA的翻译，从而参与到细胞的分化、发育、增殖、凋亡等生物学进程的调控。近年的研究表明miRNAs在肿瘤的发生发展中起到至关重要的作用，在乳腺癌中也不例外。MicroRNA-204(miR-204)现已被证实在胃癌、子宫内膜癌、乳腺癌中低表达，并且通过与靶基因结合，参与到相关细胞通路，进而影响肿瘤的发生发展。我们课题的前期研究表明，miR-204在乳腺癌中低表达，并且可以抑制MDA-MCF-7乳腺癌细胞株的增殖能力，促进凋亡并使细胞阻滞在G2/M期，并且抑制细胞的迁移和转移。为了更好了解miR-204在乳腺癌中的影响及相关机制，在此做进一步的研究。 叉头框(forkhead box，FOX)蛋白家族是一类DNA结合区具有翼状螺旋结构的转录因子，目前已有17个亚族。FOX家族中参与细胞凋亡和周期调控的最重要的一个亚群是FOXO亚族。本课题组前期研究发现FOXA1可以与靶向结合miR-204，但其具体机制不明。通过超过十个以上的miRNA的靶标预测软件预测，我们发现FOXO1同样与miR-204有可能结合位点。为了进一步研究该FOXO1是否可以同miR-204靶向结合，是否可以参与到乳腺癌的发生发展的调控中。课题组预通过体外实验、生物信息学分析等方法对其进行探讨。 PI3K/AKT是与生命及肿瘤息息相关的细胞信号通路，PI3K/AKT/FOXO1通路已经被验证是参与到抑制凋亡的重要通路。FOXO1是PI3K/AKT通路下游的重要因子，我们通过研究这条通路上的相关的分子，探索miR-204是否能够靶向结合FOXO1，并通过凋亡相关通路AKT/FOXO1参与到乳腺癌的发生、发展过程中。 研究方法： 1、第一部分 miR-204和FOXO1在乳腺癌组织中的表达及临床意义 1.1、挖掘GEO(Gene Expression Omnibus)数据中的芯片数据集，整理分析miR-204在乳腺癌中的表达及临床意义。 1.2、挖掘TCGA(The Cancer Genome Atlas)数据库中的相关表达数据，整理分析miR-204和FOXO1在乳腺癌中的表达及临床意义。 1.3、利用Oncomine数据库，获取FOXO1在乳腺癌中的表达数据。 2、第二部分 miR-204对乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞的增殖、迁移、凋亡的影响 2.1、通过慢病毒转染技术构建并筛选过表达miR-204的MDA-MB-231细胞株。 2.2、利用MTT检测miR-204对MDA-MB-231细胞株的增殖影响，用划痕检测miR-204对MDA-MB-231细胞株的迁移影响，流式细胞技术检测miR-204对MDA-MB-231细胞株的周期和凋亡的影响。 3、第三部分 miR-204对FOXO1的靶向作用，与AKT/JNK/FOXO1凋亡通路的关系 3.1、qRT-PCR检测过表达miR-204的MDA-MB-231细胞株中FOXO1基因mRNA的表达情况，利用Western Blot(WB)测定FOXO1在上述细胞株中的蛋白表达情况。 3.2、双荧光素酶报告基因实验明确miR-204对FOXO1的靶向关系。 3.3、WB检测过表达miR-204的MDA-MB-231细胞株中AKT/FOXO1凋亡通路上的相关蛋白表达情况，明确miR-204与通路的关系。 研究结果： 1、第一部分miR-204和FOXO1在乳腺癌组织中表达异常，并且二者都与乳腺癌的部分临床病理参数相关。 2、第二部分在MDA-MB-231乳腺癌细胞株过表达miR-204，能够促进细胞增殖，抑制细胞迁移及凋亡。 3、第三部分miR-204能够和FOXO1直接靶向结合，并且可能与调节AKT/FOXO1通路相关，抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞株的凋亡。 研究结论： 1、第一部分miR-204和FOXO1均与乳腺癌的发生发展密切相关。 2、第二部分过表达miR-204可以影响乳腺癌细胞的生物学行为。 3、第三部分miR-204通过靶向结合FOXO1，激活AKT/FOXO1通路，抑制乳腺癌细胞凋亡。