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目的:NFIX属于核因子I(Nuclear factor I,NFI)家族的一员,该家族还包括NFIA、NFIB和NFIC三个成员。该转录因子家族可以通过与靶基因启动子区的特定序列结合激活或者抑制靶基因的转录。NFIX在许多生命过程中发挥重要的作用,有研究发现,在Nfix基因敲除鼠中出现生长延迟和严重的骨骼发育不良现象,主要表现为软骨内骨化受损、矿化延迟,脊柱变形、脊椎小梁骨和皮质骨变薄,股骨骨骺生长板增大,小梁骨量减少,骨形成受损。这提示我们NFIX可能参与调控骨发育。这些生物表型提示NIFX可能调控骨髓基质干细胞的成骨分化,相关内容尚未见文献报道。本研究主要探讨转录因子NFIX对骨髓基质干细胞定向分化的影响及其作用机制。方法:1、利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR)方法检测6周龄C57BL/6J小鼠各组织、老年模型鼠和OVX模型鼠骨组织,以及ST2细胞成脂和成骨分化过程中Nfix m RNA的表达水平。2、在ST2和C3H10T1/2细胞中转染Nfix过表达质粒或Nfix si RNAs,之后进行成脂诱导,运用油红O染色(oil red O staining)、q RT-PCR及蛋白质免疫印迹(Western blotting,WB)等技术探究NFIX对脂肪细胞分化的影响。3、在ST2和MC3T3-E1细胞中转染Nfix过表达质粒或Nfix si RNAs,之后进行成骨诱导,运用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色、q RT-PCR及Western blotting等技术探究NFIX对成骨细胞分化的影响。4、构建Nfix敲减慢病毒(Nfix-sh RNA LV)并通过人肾上皮细胞系293T进行包装,感染原代骨髓基质细胞(Bone marrow stromal cells,BMSCs)后进行成骨/成脂诱导,运用碱性磷酸酶染色、油红O染色、q RT-PCR及Western blotting等技术探究Nfix-sh RNA LV对BMSCs向成骨细胞/脂肪细胞分化的影响。5、在ST2细胞中过表达NFIX,转染48h后收获细胞提取总RNA,将其送至上海美吉生物公司进行RNA-Seq测序,筛选NFIX的下游靶基因,并利用q RT-PCR技术验证测序结果。6、根据TFBIND网站(http://tfbind.hgc.jp)提供的顺式作用元件预测数据库对Hmga1(High-mobility group A1,Hmga1)启动子区的核苷酸序列进行分析,预测转录因子NFIX的潜在结合位点;构建含有Hmga1启动子区序列的荧光素酶表达载体,通过双荧光素酶报告基因实验验证NFIX对Hmga1启动子转录活性的影响。7、构建Hmga1过表达质粒,在ST2细胞转染后进行成脂/成骨诱导,运用q RT-PCR、Western blotting、油红O染色/碱性磷酸酶染色等技术探究HMGA1对成骨细胞、脂肪细胞分化的影响。8、ST2细胞中转染Hmga1过表达质粒或Nfix过表达质粒或Nfix si RNAs,利用Western blotting方法检测经典Wnt/β-catenin信号通路相关基因蛋白水平的表达变化。结果:1、小鼠肌肉、大脑、心脏、骨、肾周脂肪、腹股沟脂肪、棕色脂肪、肝脏中Nfix m RNA的表达水平较高;在老年模型鼠和OVX模型鼠颅盖骨中,Nfix m RNA的表达水平显著下降;在ST2细胞成骨分化过程中,Nfix m RNA表达水平升高,并在成骨诱导第7d达到峰值;在ST2细胞成脂分化过程中,Nfix m RNA表达水平也升高,并在成脂诱导第3d达到峰值。2、碱性磷酸酶染色显示在ST2细胞和MC3T3-E1细胞中过表达NFIX可以促进其分化为成骨细胞,成骨特异性转录因子Runx2、Ostrix和成骨标志基因碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)的m RNA和蛋白表达水平均显著增加;相反,敲减内源性NFIX表达则成骨分化减弱,成骨分化相关因子Runx2、Ostrix、ALP和OPN的m RNA和蛋白表达水平均显著降低。3、在ST2细胞和C3H10T1/2细胞中过表达NFIX可以抑制其分化为脂肪细胞,成脂分化相关因子PPARγ、C/EBPα、a P2、adipsin的m RNA表达水平显著降低,PPARγ、C/EBPα和a P2的蛋白表达水平降低;相反,敲减内源性NFIX表达之后则可以促进成脂分化。4、成功构建敲减慢病毒Nfix-sh RNA LV,感染BMSCs后可以有效降低细胞中Nfix m RNA的表达水平;Nfix-sh RNA LV可以抑制BMSCs向成骨细胞分化,成骨分化相关因子的m RNA和蛋白表达水平均降低;Nfix-sh RNA LV可以促进BMSCs向脂肪细胞分化,成脂分化相关因子的m RNA和蛋白水平表达均增加。5、RNA seq测序结果显示,过表达NFIX后621个基因的表达出现差异,其中有包括HMGA1在内的362个基因表达上调。通过q RT-PCR方法验证发现,过表达NFIX后Hmga1的m RNA表达水平增加,抑制内源性NFIX表达之后,Hmga1的m RNA表达水平降低。6、双荧光素酶报告基因实验证明,过表达NFIX可以增加Hmga1启动子的转录活性。7、成功构建Hmga1过表达质粒,转染到ST2细胞后可以有效增加细胞中HMGA1的表达水平;过表达HMGA1可以促进其向成骨细胞分化,成骨分化相关因子的m RNA和蛋白表达水平均显著增加;过表达HMGA1可以抑制其向脂肪细胞分化,成脂分化相关因子的m RNA和蛋白表达水平均降低。8、在ST2细胞过表达NFIX或HMGA1后,反映经典Wnt/β-catenin信号通路活性的相关因子蛋白水平变化明显,p-LRP6、p-GSK3β(Ser9)、TCF7L2、nonp-β-catenin的蛋白水平均增加,t-LRP6、t-GSK3β、t-β-catenin的蛋白水平没有明显变化;抑制内源性NFIX表达之后,p-LRP6、p-GSK3β(Ser9)、TCF7L2、nonp-β-catenin的蛋白水平均降低,t-LRP6、t-GSK3β、t-β-catenin的蛋白表达水平没有明显变化;结论:1、6周龄C57BL/6J小鼠组织分布中,Nfix m RNA在骨和脂肪组织中表达水平较高,提示NFIX可能参与成骨细胞、脂肪细胞分化的调控;2、NFIX可以促进骨髓基质干细胞向成骨细胞分化,抑制其向脂肪细胞分化;3、NFIX可以转录调控Hmga1的表达,进而激活Wnt/β-catenin信号通路,促进骨髓基质干细胞向成骨细胞分化,抑制其向脂肪细胞分化。