研究背景和目的近几年来,随着全世界老年化人口数量的不断增加,患有类风湿性关节炎的病人人数也在不断增加,目前患有类风湿性关节炎的病人总数已占世界总人口的2%左右,尤其是年龄在40岁至60岁的中老年女性。虽然各种炎症介质、细胞因子、趋化因子在类风湿性关节炎发病过程中的作用已经有了许多研究,但类风湿性关节炎的病因和发病机制目前仍不完全清楚。类风湿性关节炎的主要临床表现是侵蚀性、对称性的多关节炎,并会逐渐出现骨与关节软骨的结构破坏,严重的将会导致整个关节的畸形及功能的丧失,给个人和整个社会带来沉重的负担[1]。大量的临床研究表明,类风湿性关节炎的早期治疗可以非常有效的控制症状,诱导缓解并最大程度的减少病人的关节损害[2]。因此,对于如何有效提高类风湿性关节炎的早期诊断,是对治疗类风湿性关节炎以及类风湿性关节炎的预后有着重大的临床意义。尽管类风湿性关节炎的发病机制尚未完全阐明,但是越来越多的证据都表明巨噬细胞是类风湿性关节炎发病机理中的关键效应细胞[3,4],这是因为巨噬细胞是早期导致滑膜炎症的主要细胞因子来源[5]。因此,设计并构造一种在类风湿性关节炎发病早期精准靶向于病灶处的巨噬细胞的显像探针,我们就可以早期诊断类风湿性关节炎,为接下来的临床治疗提供一定的指导意义。易位蛋白18kDa（TSPO）是一种线粒体膜蛋白,在活化的巨噬细胞中上调。已有研究表明,TSPO蛋白在炎症区域的巨噬细胞调节中发挥重要作用[6,7]。因此,TSPO被认为是炎症性疾病筛查和治疗的合适生物标志物候选者[8,9]。本文通过将特异性靶向TSPO蛋白的小分子探针CB86鳌合顺磁性金属元素钆离子,以及连接荧光材料Cy5.5,分别构建了两种靶向TSPO蛋白的新型核磁共振T1增强造影剂CB86-DTPA-Gd以及荧光显像剂CB86-Cy5.5。通过对两种探针的理化性质、细胞毒性、材料稳定性、生物分布和活体显像研究,以期实现对早期类风湿性关节炎的疾病诊断。实验方法1、用CB86连接DTPAA（二乙三胺五乙酸）,接着鳌合Gd3+,连接后的产物经过纯化后进行理化性质的测定。2、用CB86连接荧光染料Cy5.5,连接后的产物经过纯化后进行理化性质的测定。3、向类风湿性关节炎模型鼠通过尾静脉分别注射CB86-DTPA-Gd和Gd-DTPA,行小动物活体核磁共振显像,分别采集尾静脉注射探针后10分钟、30分钟、60分钟、90分钟的右侧踝关节的磁共振图像,并测量其感兴趣区（ROI）的信噪比（SNR）。之后再通过与CB86-DTPA共注射行阻断性显像,证明CB86-DTPA-Gd对于炎症关节处的特异靶向性。4、分别将尾静脉注射CB86-DTPA-Gd的模型鼠按照不同的时间点（30分钟、60分钟、90分钟、120分钟）进行解剖,取出主要脏器和炎症关节与正常对侧关节,准确测量重量后用浓硝酸和双氧水溶解,然后行电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）检测各个组织器官中的Gd3+浓度。5、向类风湿性关节炎模型鼠通过尾静脉注射CB86-Cy5.5和Cy5.5,行小动物活体荧光显像,分别采集尾静脉注射探针后10分钟、30分钟、60分钟、90分钟、120分钟、240分钟的荧光信号图像。并测量右侧关节处相同感兴趣区（ROI）的荧光强度值。之后再通过将CB86-Cy5.5与CB86共注射行阻断性显像,证明CB86-Cy5.5对于炎症关节处的特异靶向性。6、将尾静脉注射CB86-Cy5.5的模型鼠按照不同的时间点（10分钟、30分钟、60分钟、90分钟、120分钟、240分钟）进行解剖,取出主要脏器和炎症关节与正常对侧关节,行荧光成像,并测量各个器官相同大小感兴趣区（R0I）的荧光强度值。7、向类风湿性关节炎模型鼠通过尾静脉注射CB86-Cy5.5,行小动物活体光热显像,分别采集尾静脉注射探针后1min、2min、3min、4min、5min的光热信号图像。实验结果1、CB86-DTPA分子量的理论计算值为759.3,经纯化后,产物的质谱值为759.03。HPLC的出峰时间为24.72min。CB86-DTPA-Gd分子量的理论计算值为916.23,经纯化后,产物的质谱值为917.16,。HPLC的出峰时间为21.45min。CB86-DTPA-Gd的纵向驰豫时间r1为11.05/mM/sec,达到了商用造影剂Gd-DTPA弛豫率的2.3倍（4.94/mM/sec）。CB86-DTPA-Gd在生理盐水中的稳定性较好,在人血清中的稳定性略有下降。2、CB86-Cy5.5分子量的理论计算值为445.8,经纯化后,产物的质谱值为445.4。CB86-Cy5.5的最大激发波长为674nm,最大发射波长在680nm。3、在注射CB86-DTPA-Gd或Gd-DTPA之前和之后的10分钟、30分钟、60分钟和90分钟扫描类风湿性关节炎小鼠的右侧踝关节。在注射CB86-DTPA-Gd或Gd-DTPA 之前,右侧 RA 踝关节和对侧正常踝关节的 MRI 图像是暗的。在给予Gd-DTPA 后,Gd-DTPA 在短时间内非特异性地分布在双侧踝关节。右侧RA踝关节变亮,右踝关节的信噪比（SNR）有所增加。注射CB86-DTPA-Gd后,右侧踝关节信号比对侧正常踝关节更亮,右侧踝关节的SNR增加的更为明显。当与CB86-DTPA共注射时,右侧炎症踝关节的SNR与单纯注射CB86-DTPA-Gd相比明显下降。4、尾静脉注射CB86-DTPA-Gd后30分钟,模型鼠的右侧炎症踝关节处Gd3+远低于肝脏、肾脏和肺,但之后,Gd3+迅速从肝脏排出,右侧炎症踝关节处的Gd3+积累增加。在120分钟时,右侧炎症踝关节的Gd3+积累显著高于包括肝脏在内的正常组织。注射后30分钟到120分钟内,肌肉和对侧正常脚踝始终观察到较低水平的Gd3+积累。5、尾静脉注射CB86-Cy5.5的模型鼠从10分钟开始,右侧关节炎症处的信号逐渐升高,在90分钟时达到最大水平,随后逐渐降低。而单独尾静脉注射Cy5.5的模型鼠右侧关节炎症处的信号较前一组低很多,且在60分钟就达到了信号的最大值。当CB86-Cy5.5与CB86共注射时,右侧关节炎症处的信号受到明显的抑制。6、在尾静脉注射CB86-Cy5.5的最初10分钟时,肝脏处的荧光信号强度最大,肺、肾脏和炎症关节处也都能观察到较高的荧光信号。到了 90分钟,肝脏、肺和肾脏的信号已经明显减弱,炎症关节处的信号强度达到了最大值,注射后10分钟到240分钟,肌肉和对侧正常脚踝始终观察到较低水平的荧光信号强度。7、除右侧炎症踝关节温度升高外,身体其他部位没有明显的温度升高。结论本实验首次通过将CB86连接DTPA,之后鳌合Gd3+,或者CB86直接连接Cy5.5,构建了两种新型的靶向类风湿性关节炎炎症关节处的小分子探针,通过对尾静脉注射不同探针的老鼠行核磁共振显像或者荧光显像,验证了这两种探针皆可以用于小动物活体成像,从而对小鼠类风湿性关节炎模型进行早期的诊断。这对我们今后对类风湿性关节炎的病理机制以及早期治疗都发挥了重要的指导作用。