原发性肝癌是居中国第二位的恶性肿瘤，全世界每年新发肝癌的一半以上发生在我国。肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)易于侵犯门静脉形成癌栓(portal vein tumor thrombus，PVTT)导致肿瘤细胞的播散和转移。至今仍然难有一种手段能够早期发现或预测PVTT的形成。PVTT的形成是多因素、多步骤的生物学现象，单因素和局限在基因水平的研究难以全面揭示PVTT形成的分子机制，对PVTT的研究必须建立在高通量的基因组学和蛋白质组学基础上。双向凝胶电泳(two-dimensional electrophoresis，2-DE)和质谱(mass spectrometry，MS)技术的联合应用为蛋白质组的分析提供了研究平台。本研究利用低分子量2-DE结合基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS／MS)，对有或无PVTT的原发瘤组织中的蛋白质组进行比较，筛选出有差异的小分子蛋白，并利用RNA干扰技术对其中的S100A11蛋白进行了初步的细胞功能学验证，发现其可能与肝癌的侵袭转移生物学特性相关。利用组织芯片技术对S100A11的临床验证发现，S100A11的表达与肝癌的侵袭性相关，S100A11阳性表达可能是肝癌预后不良的潜在指标。第一部分肝癌门静脉癌栓相关小分子的比较蛋白质组学分析本部分通过改变双向电泳第二向SDS-PAGE胶浓度和电泳缓冲系统成分，优化2-DE相关技术，建立分子量低于20kD蛋白质电泳技术平台。然后应用相对稳定、标准的2-DE及基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS／MS)对有或无PVTT的人肝癌原发瘤组织中的差异蛋白质组进行分析比较，筛选在PVTT形成过程中起重要作用的低分子量蛋白质标记物。结果：1．16％SDS-PAGE凝胶中，3～20kD区域内蛋白条带间距较12.5％SDS-PAGE明显变宽，条带数目明显增多；两组肝癌组织小分子量蛋白表达图谱中均可以清晰显示分子量低20kD的小分子蛋白斑点。2．相同条件下分别对无PVTT组和PVTT组的蛋白质样品重复进行3次2-DE，无PVTT组平均检测到764±56个蛋白点(n=3)，PVTT组平均检测到799±44个蛋白点(n=3)，以每组蛋白点最多最清晰的胶作为组内参考胶，无PVTT组的平均匹配点数为687±30个，PVTT组的平均匹配点数为701±21个，组内匹配率分别为89.87％和87.77％。3．以PVTT组内参考胶作为组间参考胶，两组间平均匹配点数为393±42个，组间匹配率为51.44％。不同凝胶之间蛋白质斑点的位置偏差IEF(等电聚焦)方向为(2.95±0.95)mm，SDS-PAGE方向为(2.87±0.88)mm。以蛋白质点的胶内校正强度值进行组间比较，比值大于等于2倍者被定义为差异点，无PVTT和PVTT的原发瘤组织间共检测到88个差异点，其中分子量低于20kD的差异点有42个。与无PVTT组相比，PVTT组中有41个蛋白点表达上调(其中19个分子量低于20kD)，47个蛋白点表达下调(23个分子量低于20kD)。4．挖取其中36个差异蛋白点并经质谱鉴定，去除冗余后共发现钙结合蛋白S100A11，脂肪酸结合蛋白-1等11种胶内差异小分子蛋白质。5．Western blot验证结果证实S100A11在有或无PVTT的原发瘤组织中的确存在表达差异。第二部分差异表达蛋白S100A11在侵袭转移潜能不同的人肝癌细胞系中的表达和功能验证本部分解析差异蛋白S100A11的生物学功能，证实其是否在肝癌细胞侵袭和转移中发挥作用。首先选择Hep3B、MHCC97L、MHCC97H和HCCLM6等4种侵袭转移潜能不同的人肝癌细胞系，验证S100A11在细胞系中的差异表达，然后化学合成三组S100A11的siRNA，以脂质体分别转染高侵袭转移潜能人肝癌细胞系HCCLM6，筛选出干扰效果明显的两组siRNA，通过细胞运动实验、细胞侵袭实验、细胞划痕实验等检测，观察目的蛋白S100A11表达下调后对HCCLM6细胞生物学行为的影响。结果：1．应用real-time PCR和Western blot检测S100A11在4种侵袭转移潜能不同人肝癌细胞系Hep3B、MHCC97L、MHCC97H和HCCLM6中的表达情况，结果发现S100A11在4种细胞系中存在表达差异，表达量随细胞侵袭转移潜能增强而升高。2．三对siRNA中S100A11表达的抑制率分别为73.1％，88.6％和91.0％，与阴性对照siRNA相比，差异具有统计学意义(P＜0.01)。在细胞融合度为40～50％、siRNA浓度为100nM、转染时间为48h的条件下，S100A11表达的抑制效果最佳。3．细胞侵袭实验结果显示穿过人工基底膜细胞数在两组S100A11干扰组中为55.0±10.0和41.0±5.6，阴性对照组中为153.0±11.0，空白对照组中为165.0±7.2，干扰组穿越的细胞显著减少(P＜0.05)。4．细胞运动实验结果发现细胞穿过上室底膜的细胞数在两组S100A11干扰组中为96.0±9.7和78.0±14.0，阴性对照组中为211.0±18.1，空白对照组中为225.0±15.8，干扰组穿越的细胞显著减少(P＜0.05)。5．细胞划痕实验结果发现抑制细胞分裂48h后细胞迁移距离在S100A11干扰组中为35.00±11.07μm，阴性对照组中为81.98±12.11μm，空白对照组中为119.98±8.17μm，干扰组的细胞迁移速度显著降低(P＜0.05)。第三部分S100A11在肝癌原发瘤组织中的表达状况及临床意义本部分利用组织芯片和免疫组化技术检测192例肝癌原发瘤组织中S100A11的表达情况，比较分析S100A11的表达与PVTT和其他临床病理特征的关系，以以受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve，ROC curve)比较肝癌原发瘤组织与癌旁组织中S100A11表达与肝癌侵袭的相关性，评价S100A11作为肝癌预后判断指标的意义。结果：1．S100A11在肝癌组织中表达阳性率为43.75％，在无癌栓组、镜下癌栓组和肉眼癌栓组中的表达依次增强，差异具有统计学意义(P＜0.01)。2．S100A11升高与单个肿瘤最大直径＞5cm、病理低分化、肿瘤无完整包膜、肿瘤边界不清、肿瘤侵犯血管、存在播散灶以及肿瘤TNM分期晚等临床病理因素相关(P＜0.05)。3．ROC曲线提示肿瘤组织中S100A11的表达越高，肝癌的侵袭力越强。结论1．16％的SDS-PAGE结合Tris-Tricine电泳缓冲系统能够良好的显示分子量低于20kD的蛋白和多肽。PVTT的原发瘤组织与无PVTT原发瘤组织中存在差异表达的低分子量蛋白，推测有多种差异蛋白与肝癌的侵袭转移特性相关，S100A11可能是其中一种。2．人肝癌细胞系中S100A11表达量的高低与细胞侵袭转移潜能强弱相关。抑制高侵袭转移潜能细胞中S100A11的表达可以降低其运动侵袭能力，提示差异蛋白S100A11通过增强肝癌细胞的运动侵袭能力来参与肝癌细胞的侵袭转移过程，可能与PVTT的形成有一定关联。3．S100A11在预测肝癌的侵袭力中具有一定的临床意义，S100A11阳性表达是肝癌预后不佳的信号。联合分析S100A11与其他临床病理指标，对于判断患者术前是否已有血管侵犯以及术后是否有复发转移的可能，以便及早采取针对性干预措施具有一定的参考价值。潜在应用价值1．S100A11可作为肿瘤侵犯血管及肝癌转移的诊断标志物及肝癌预后指标。2．对S100A11的上游和下游调控的进一步研究，有助于揭示PVTT形成以及肝癌侵袭转移的分子机制。创新点1．对现有蛋白质组学技术进行改进，使之更适合低分子量蛋白和多肽的分离筛选，为研究小分子蛋白标记物奠定基础。2．首次证实差异蛋白S100A11在人肝癌细胞系侵袭转移中发挥作用。3．S100A11可能成为预测肝癌预后的分子指标。