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第一部分转录因子Tcf7l2在髓鞘发育过程中功能影响的研究目的：通过条件性敲除（cKO）转录因子Tcf7l2（也称Tcf4）,以研究Tcf7l2对中枢神经系统（CNS）髓鞘发育功能的影响。方法：以Cnp-Cre/Tcf7l2fl/fl及Olig2-Cre/Tcf7l2fl/fl（Tcf7l2 cKO）这两种小鼠为实验组,Tcf7l2fl/fl（Tcf7l2未敲除）小鼠为对照组,在小鼠出生后不同时间点（P0、 P7.P14.P21.P30.P45.P60.P90不P120）,研究CNS髓鞘发育过程中Tcf7l2对其功能的影响。运用转棒行为学、原位杂交、Western-blot、免疫荧光以及透射电子显微镜等技术手段,比较两组小鼠在行为学、髓鞘相关基因的mRNA水平、蛋白水平以及髓鞘超微结构等方面的差异。结果：①转棒行为学。与对照组比较,Cnp*Cre/Tcf7l2fl/fl组P30、P45和P60小鼠在转棒仪上停留的时间明显缩短（P<0.05）；Tcf7l2 cKO组P90小鼠（P=0.131）和P120小鼠（P=0.087）有缩短趋势。②原位杂交。与对照组比较,Cnp-Cre/Tcf7l2fl/fl组P0、P7小鼠脊髓的髓鞘相关基因髓鞘碱性蛋白（Mbp）和蛋白脂质蛋白（Plp）的mRNA表达量显著减少（P<0.05）；Olig2-Cre/Tcf7l2fl/fl组 P0、P21,小鼠Plp的mRNA表达量显著减少（P<0.05）。③Western-blot.与对照组比较,Cnp-Cre/Tcf7l2fl/fl组P30小鼠胼胝体的髓鞘相关蛋白环核苷酸磷脂水解酶（Cnp）和Mbp的表达量显著减少（P<0.01）。④透射电子显微镜。与对照组比较,Olig2-Cre/Tcf7l2fl/fl组P21小鼠脊髓的髓鞘厚度显著变薄；髓鞘厚度量化分析显示g-ratio值（轴突直径二[轴突直径+髓鞘直径]）显著增大（P<0.001）。⑤免疫荧光。与对照组比较,Tcf7l2 cKO组小鼠脊髓少突胶质细胞前体细胞（OPC）的标记分子NG2的表达量无显著差异（P>0.05）；两组之间少突胶质细胞（OL）的增殖（Ki67）量无明显差异（P>0.05）；两组之间星形胶质细胞的标记分子GFAP和神经元的标记分子NeuN的表达量均无显著差异（P>0.05）。结论：转录因子Tcf7l2可促进OL分化、髓鞘发育和形成,且不影响OPC的数量,OL的增殖,星形胶质细胞及神经元。第二部分转录因子Tcf7l2在髓鞘再生过程中功能影响的研究目的：研究CNS髓鞘载生过程中,,转录闪子Tcf/12对髓鞘再生功能的影响。方法：以Cnp-Cre/Tcf7l2fl/fl小鼠为实验组,Tcf7l2fl/f小鼠为对照组。我们分别给两组成年8-10周大小的雄性小鼠持续喂食0.2%双环己酬草酰二腙（cuprizone）6周,诱导其脱髓鞘损伤,建立脱髓鞘动物模型；6周后两组小鼠均恢复正常饮食2周。运用转棒行为学、依来铬氰染色、原位杂交和免疫荧光等技术手段,比较两组小鼠在行为学、形态学、髓鞘相关基因的mRNA水平和蛋白水平等方面的差异,以观察两组小鼠的髓鞘载生情况。结果：（①）转棒行为学。在喂食0.2%cuprizone第3周时,Tcf7l2 cKO组小鼠在转棒仪上停留的时间较对照组显著缩短（P<0.05）；恢复正常饮食2周后（第7、8周）,对照组小鼠在转棒仪上停留的时间较Tcf7l2 cKO组明显延长（P<0.05）,且几乎恢复至喂毒索之前,而Tcf7l2 cKO组在转棒仪上停留的时间没有明显恢复。②依来铬氰染色。0.2% cuprizone持续喂食6周后,两组小鼠肼胝体均几乎完全脱髓鞘,肼胝体区域均未着色。恢复正常饮食2周后,对照组小鼠的胼胝体明显着色,髓鞘得到修复,而Tcf7l2 cKO组胼胝体仍未着色。③免疫荧光。0.2%cuprizone持续喂食6周后,两组小鼠胼胝体的髓鞘相关蛋白腺瘤性结肠息肉病蛋白（Apc）的表达均儿乎消失。恢复正饮食2周后,Tcf7l2 cKO组胼胝体的髓鞘相关蛋白Cnp、Mbp和Apc的表达量均较对照组显著减少；两组小鼠OPC的标记分子Pdgfra的表达量相似,两组之间无显著差异（P>0.05）。④原位杂交。恢复正常饮食2周后,Tcf7l2 cKO组胼胝体的髓鞘相关基因Mbp的mRNA表达水平较对照组显著减少。结论：转录因子Tcf7l2促进OL的分化和髓鞘再生,并且不影响OPC的数量。第三部分转录因子Tcf7l2在髓鞘发育与再生中影响的机制研究目的：探索转录因子Tcf7l2对髓鞘发育与再生影响的分子机制。方法：以Cnp-Cre/Tcf7l2fl/fl小鼠为实验组,Tcf7l2fl/fl小鼠为对照组,分别进行体内实验和体外OL培养。在体内实验中,分别提取两组小鼠发育时间点P14的胼胝体蛋白,运用Western-blot实验技术,比较两组小鼠在发育过程中Wnt/β-catenin、 PI3K等信号通路下游靶蛋白表达水平的差异。在体外实验中,分别取P0～P2大小的两组小鼠鼠婴的皮层,行OL培养,然后分别提取分化早期和晚期的两组OL细胞的RNA,运用RNA 测序和RT-qPCR等技术手段,比较两组细胞髓鞘相关基因、转录因子Tcf7l2参与的相关信号通路如经典Wnt/p-catenin、PI3K等信号通路的上下游靶基因mRNA表达水平的差异。结果：①体内RT-qPCR实验。在发育时间点Pl4, Tcf7l2cKO的胼胝体Tcf7l2敲除效率约75%,实验组胼胝体Cnp、Mbp和Mag的mRNA表达水平较对照组显著减少（P均<0.01）,Pdgfra的nRNA表达水平无显著差异（P>0.05）。Tcf7l2 cKO的胼胝体中Tcf7l2 cKO中胼胝体Wnt/β-catenin信号通路的部分靶基因Wnt5b、 Wnt7b、Gpc4和Fosl1等较对照组明显降低（P均<0.001）。另外,PI3K信号通路的部分靶基因Thbs2、Thbs1、Lpar1和Sppl等的mRNA表达水平明显较对照组减低（P均<0.001）。②体内Western-blot实验。体内实验,在发育时间点P14, Tcf7l2 cKO小鼠肼胝体的PI3K信号通路下游靶蛋白P-Akt的表达量较对照组显著减少（P<0.001）,Akt的表达量在两组间无显著差异（P>0.05）。③免疫荧光。在OL分化早期,Tcf7l2 cKO组Cnp的表达量较对照组显著减少；在OL分化晚期,Tcf7l2 cKO组Cnp、Mbp和Nkx2.2的表达量均较对照组显著减少；两组细胞Pdgfra、Olig2和Ki67的表达量相似。④RNA测序。在OL分化早期,Tcf7l2 cKO组经典Wnt/β-catenin信号通路的下游相关靶基因Wnt5b、Wnt7b、Fos11和CD44的mRNA表达水平较对照组显著降低；Tcf7l2 cKO组P13K信号通路的下游部分靶基因Epha2、Tnr、Itga3, Lpar1、Itga7、Vwf、Thbs2、Cdknla和Thbs1等的mRNA表达水平也较对照组明显降低。在OL分化晚期,Tcf7l2 cKO组P13K信号通路的下游部分靶基因Lama2、Collla2、Col6a5、Angpt2合Csflr的mRNA表达水平校对照组明显降低；Notch信号通路的的靶基因Hes5的mRNA表达水平较对照组明显增高；Hedgehog信号通路的下游相关靶基因Bmp4、Gli2、Gli3和Shh的mRNA表达水平也较对照组明显增高。⑤体外RT-qPCR实验。在OL分化早期,TCF/LEF1转录因子家族中,Tcf7l2敲除效率约80%,其他家族成员中Tct7H和Lef1的mRNA表达水平较对照组明显代偿性增高（P<0.001）,而Tcf7无明显改变（P>0.05）。Tcf7l2 cKO组髓鞘相关基因Cnp和Mbp的mRNA水平明显降低（Cnp, P<0.05; Mbp, P< 0.01）,两组之间Pdgfra的mRNA水平无显著差异（P>0.05）。Tcf7l2 cKO组经典Wnt/β-catenin信号通路的部分靶基因Wnt5b、Wnt7b、Fosl1和Gpc4等的mRNA表达水平较对照组显著减少（P均<0.001,除外Wnt5b,P<0.05）。PI3K信号通路的部分靶基因Thbs2、Spp1、Csflr、Thbs1、Lpar1、Jak3和Itga3等的mRNA表达水平较对照组显著减少（P均<0.001,除外Thbsl, P< 0.05）。在OL分化晚期,TCF/LEF1转录因子家族中,Tcf7l2基因敲除效率75%左右,其他成员中Lefl的mRNA表达水平较对照组明显代偿性增高（P<0.01）,而Tcf7和Tcf711无明显改变（P>0.05）。Tcf7l2 cKO组髓鞘相关基因Cnp、Mbp和Mag的mRNA表达水平明显降低（Cnp和Mbp, P< 0.01; Mag, P< 0.001）,两组之间Pdgfra的mRNA表达水平无显著差异（P>0.05）。Notch信号通路下游靶基因Hes5的mRNA表达水平较对照组明显增高（P<0.001）；Hedgehog信号通路的相关靶基因Bmp4、Gli2、Gli3和Shh等mRNA的表达水平较对照组明显增高（P均<0.001）；BMP4信号通路的相关靶基因Smad1、Smad2、Smad7和Id2等的mRNA表达水平在两组之间无显著差异（P>0.05）。而Tcf7l2 cKO组的Wnt/β-catenin信号通路的个别靶基因Nkx2.2的mRNA的表达水平较对照组明显减低（P<0.001）。RT-qPCR和RNA测序实验结果基本一致。结论：在OL分化发育早期,Tcf7l2通过激活经典Wnt/β-catenin和PI3K信号通路促进其分化发育和髓鞘形成；在OL分化晚期,Tcf7l2主要通过抑制Notch和Hedgehog等抑制OL分化发育的信号通路,从而促进OL分化发育和髓鞘形成。