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背景心力衰竭的发病率和死亡率高居不下,心力衰竭患者的预后不佳。目前的神经内分泌拮抗治疗并不能完全解决心衰难题,因此需要发现心力衰竭治疗的新策略。心肌肥厚是心力衰竭的关键病理生理过程。心肌肥厚是心脏在遭受损伤时,心脏从大体到基因水平系统性重构的过程,这个过程会出现心脏增大或缩小、肌节排列紊乱和心肌纤维化、心肌细胞凋亡和肥大及成纤维细胞的增殖转变、相关信号通路的激活和成熟型基因向胚胎型基因的转变。探究心肌肥厚的演变机制,可为心力衰竭的临床干预提供理论基础和方向。心肌肥厚的过程中既涉及到心肌细胞和非心肌细胞生物学特性的改变,也涉及到心肌细胞和非心肌细胞相互作用。大量研究事实证明,成纤维细胞、内皮细胞和炎症细胞可以通过旁分泌或者自分泌的形式调控心肌细胞,影响心肌肥厚的进程。据报道,CD4+T细胞在心肌肥厚中表达上调。小鼠CD4+T细胞缺陷可减轻压力负荷诱导的心肌肥厚,改善小鼠心功能。这提示我们针对于T细胞的免疫调节可能是心肌肥厚和心力衰竭治疗的新策略。T-bet （T-box expressed in T cell）是2000年新发现的T-box家族成员。T-bet含有T盒结构。作为天然免疫和获得性免疫的桥梁,T-bet主要在多种免疫细胞上表达,如CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞及自然杀伤细胞（NK cells）。作为转录因子,T-bet可通过调控干扰素γ等维持T辅助细胞1 （T helper 1, Thl）/Th2的平衡。T-bet参与多种疾病的进程。T-bet基因敲除的小鼠表现出自发性的气道高敏感性,这与T-bet小鼠敲除后Th2反应增强密切相关。T-bet敲除后小鼠可抵抗Ⅰ型糖尿病的发生。T-bet也参与调控心血管疾病。小鼠T-bet敲除后可减轻动脉粥样硬化,减轻炎症反应；但却可以通过IL-17加重自身免疫性心肌炎。然而,T-bet是否参与心肌肥厚的过程,国内外均未见报道。本课题应用T-bet基因敲除的大鼠探究T-bet对于心肌肥厚的影响,并阐述其潜在的机制。方法第一部分：选取体重在180-200g雄性SD大鼠作为实验对象,所有动物随机分为假手术组（Sham）和手术组。手术组利用腹主动脉缩窄术（AAC）建立压力负荷诱导的大鼠心肌肥厚模型。分别于AAC术后5周、10周、14周、18周及23周进行超声心动图检测,评价心脏大小。术后18周检测T-bet表达改变情况。第二部分：实验动物体重控制在180-200g,实验动物为雄性SD大鼠（T-bet+/+）和雄性T-bet敲除（T-bet-/-）大鼠,动物随机分为sham组和AAC组：T-bet+/+sham组、T-bet+/+AAC组、T-bet-/-sham组和T-bet-/-AAC组。AAC术后5周、10周、14周和18周进行超声检测,18周后评价心重；病理染色评价心肌细胞横截面积和纤维化,PCR检测心肌肥厚和纤维化标志物的改变；免疫组化检测炎症浸润情况。第三部分：首先分离心肌细胞和成纤维细胞,给予刺激后,检测心肌细胞横截面积（Cross-sectional area. CSA）、心房钠尿肽（Atrial natriuretic peptide, ANP）和胶原分泌。选取150-180g的SD雄性大鼠和T-bet敲除雄性大鼠作为骨髓移植的供体,选取180-200g的SD雌性大鼠和T-bet敲除雌性大鼠作为移植受体。移植后检测血常规变化,移植后30天检测血液中睾丸决定因子。移植后60天,所有动物随机分为sham组和AAC组：野生型（WT） to WT sham、WT to敲除（KO）sham、KO to WT sham、KO to KO sham组；模型组（AAC）分为WT to WT AAC、 WT to KO AAC、KO to WT AAC、KO to KO AAC组。AAC术后18周行超声检测,超声后取材；病理染色评价心肌细胞横截面积和纤维化,PCR检测心肌肥厚和纤维化标志物的改变；免疫组化检测炎症浸润情况。CD4+T细胞分离采用阳性筛选方法。CD4+T细胞经CD3和CD28共刺激后检测趋化因子的改变。T细胞移植实验动物分为T-bet-/-+T-bet-/-CD4+T sham组、T-bet-/-+T-bet+/+CD4+T sham组、T-bet-/-+T-bet-/-CD4+T AAC组和T-bet-/-+T-bet+/+CD4+T AAC细胞组。T细胞分别于术前的3d和术后10周移植到动物体内。18周后评价心重；病理染色评价心肌细胞横截面积和纤维化,PCR检测心肌肥厚和纤维化标志物的改变；免疫组化检测炎症浸润情况。第四部分：检测活化的T细胞和动物心脏IFN-y和IL-4的改变。而后选取180-200g的SD雄性大鼠和T-bet敲除雄性大鼠作为实验对象。IFN-y泵入实验中Sham分为T-bet+/+Sham+saline、T-bet-/-Sham+saline、T-bet+/+Sham+IFN-y、T-bet-/-Sham+IFN-γ组；AAC分为T-bet+/+ AAC+saline、T-bet-/-AAC+saline、T-bet+/+ AAC+IFN、T-bet-/-AAC+IFN-y组。IL-4中和实验中Sham分为T-bet+/+ Sham+saline。T-bet-/-Sham+saline。T-bet+/+Sham+anti-IL-。T-bet-/-Sham+anti-IL-4组；AAC分为T-bet+/+ AAC+salin、T-bet-/-AAC+saline、T-bet+/+AAC+anti-IL-4、 T-bet-/-AAC+anti-IL-4组。AAC术后18周行超声检测,超声后取材；病理染色评价心肌细胞横截面积和纤维化。利用活化的T细胞上清培养心肌细胞和成纤维细胞,检测心肌细胞横截面积、心房钠尿肽和胶原分泌情况。最后检测心脏STAT1信号通路。结果AAC术后,大鼠心重体重比（Heart weight/body weight, HW/BW）和心重胫骨长比（Heart weight/tibal length, HW/TL）明显升高（P<0.05）,超声结果显示左室舒张末内径（Left ventricular internal diastolic diameter, LVIDd）增加（P<0.05）,射血分数（Ejection fraction, EF）降低（P<0.05）。 AAC术后18周,心肌肥厚标志物ANP显著升高,T-bet表达显著增加（P<0.05 vssham）。免疫组化显示T-bet主要表达在细胞间质中。大鼠AAC 18周后,与T-bet+/+大鼠相比,T-bet-/-大鼠心肌肥厚明显减轻,表现为：T-bet-/-大鼠HW/BW和HW/TL降低、CSA和胶原分数显著下降（P<0.05）；T-bet-／-大鼠的心肌肥厚标志物和纤维化标志物均低于T-bet+/+大鼠（P<0.05）。超声心动图结果显示大鼠敲除T-bet后,LVIDd降低,EF升高（P<0.05）。免疫组化提示T-bet敲除后CD45+细胞和CD4+细胞浸润明显减少（P<0.05）。经苯肾上腺素（PE）刺激后,心肌细胞敲除T-bet, CSA和ANP与未敲除组相比无显著改变（P>0.05）。经成纤维生长因子-p （TGF-p）刺激后,成纤维细胞敲除T-bet,胶原分泌与未敲除组相比无显著改变（P>0.05）。骨髓移植动物AAC18周后,与WT to WT AAC和WT to KO AAC组相比,KO to WT AAC和KO to KO AAC组心肌肥厚反应减弱,体现在：KO to WT AAC和KO to KO AAC组大鼠HW/BW和HW/TL、CSA和胶原分数下降（P<0.05）；KO to WT AAC和KO to KO AAC组大鼠的心肌肥厚标志物和纤维化标志物降低（P<0.05）。超声心动图结果显示KO to WT AAC和KO to KO AAC组大鼠LVIDd降低,EF升高（P<0.05）。此外,免疫组化也证实KO to WT AAC和KO to KO AAC组的CD45+细胞心脏浸润减少（P<0.05）。分离CD4+T细胞活化后发现,与T-bet+/+相比,T-bet-/- CD4+T细胞分泌的趋化因子及趋化因子受体显著减少（P<0.05）。检测AAC术后3天的动物心脏标本发现,T-bet-/-心脏T细胞相关的趋化因子和受体减少（P<0.05）。T-bet-/-大鼠移植T-bet+/+ CD4+T细胞后心肌肥厚加重,表现为：HW/BW和HW/TL增加、CSA和胶原分数显著升高（P<0.05）。心功能明显恶化,心肌肥厚标志物和纤维化标志物显著增加（P<0.05）。免疫组化提示T细胞移植后炎症细胞心脏浸润增加（P<0.05）。检测CD4+T细胞分泌的细胞因子发现T-bet敲除后T辅助细胞1（Th1）相关的细胞因子显著降低,而Th2相关的细胞因子增高（P<0.05）。此外我们还发现IFN-γ泵入可阻断T-bet的保护作用,表现为：IFN-γ可增加T-bet-/-大鼠的HW/BW和HW/TL、CSA和胶原分数（P<0.05）。中和IL-4不能影响T-bet介导的保护作用（P>0.05）。与T-bet+/+组相比,T-bet-/- CD4+T细胞的上清共刺激心肌细胞和成纤维细胞时,肥大反应和胶原分泌减弱（P<0.05）。此外,T-bet敲除后P-STAT水平下降（P<0.05）。结论1. T-bet在大鼠心肌肥厚过程中表达上调2. T-bet基因敲除可减轻压力负荷诱导的大鼠心肌肥厚3. T-bet敲除后的心脏保护作用依赖于CD4+T细胞4. T-bet敲除后的心脏保护作用主要是缺陷的Th1反应介导5. T-bet可调控CD4+T细胞以旁分泌的途径影响心肌肥厚