论文部分内容阅读
猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)是引起初孕母猪繁殖障碍性疾病的重要病原。PPV基因组主要包含两个开放型阅读框(open reading frame,ORFs),即ORF1和ORF2。ORF1主要编码非结构蛋白NS1和NS2,ORF2主要编码结构蛋白VP1和VP2。研究报道,细小病毒NS1是一种具有DNA聚合酶、解旋酶、核酸内切酶和ATP酶等多种酶活性的多功能蛋白,在病毒DNA复制过程中发挥着关键作用。TCP1环状复合物/含TCP1伴侣蛋白(TCP1 ring complex/chaperonin containing TCP1,TRiC/CCT)是Ⅱ型伴侣蛋白中的一种,由8种不同亚基构成,CCT5是其中的一个亚基。TRiC/CCT主要协助大约10%的细胞质蛋白的折叠,也参与肿瘤相关蛋白和神经退行性疾病相关蛋白的折叠,目前研究发现,在病毒感染性疾病中,TRiC/CCT多个亚基参与了多种病毒的复制。然而,关于TRiC/CCT的亚基在PPV复制过程中的作用和机制迄今尚无报道。本研究首先通过质谱筛选并鉴定PPV NS1互作宿主蛋白,并确定CCT5为研究对象。然后,干扰cct5基因、构建cct5基因敲除和过表达细胞系,研究CCT5在PPV复制过程中的作用。最后,探索与CCT5互作的PPV NS1关键氨基酸基序,并针对此基序构建突变型PPV毒株,检测突变型PPV毒株复制水平。旨在为进一步研究PPV复制机制提供理论依据。研究取得如下结果。1.成功筛选到PPV NS1互作宿主蛋白CCT5通过His-pulldown试验筛选NS1与阴性对照SDS-PAGE差异条带并进行质谱分析,得到400个潜在NS1互作蛋白。接着,根据分子量大小和文献检索筛选得到CCT5、FHL2、GAPDH、GRB2、PKM和RACK1共6个蛋白,分别构建这6个蛋白的p GFP-N1真核表达载体,转染HEK293T细胞后均能正确表达。将互作蛋白表达载体与Flag-NS1转染PK-15细胞后,激光共聚焦检测发现,CCT5定位于细胞质和细胞核,FHL2定位于细胞质,GAPDH定位于细胞质,GRB2定位于细胞质,PKM定位于细胞质和细胞核,RACK1定位于细胞质和细胞核,CCT5、FHL2和PKM与NS1在细胞核存在共定位。Co-IP试验发现,CCT5、FHL2和PKM与NS1互作。构建CCT5、FHL2和PKM的p GEX-4T-1原核表达载体,GST-pulldown试验发现,CCT5与NS1存在直接互作。2.CCT5促进PPV的复制以1 MOI PPV感染PK-15细胞0 h、12 h、24 h、36 h和48 h,q PCR和western blotting试验检测CCT5 m RNA和蛋白表达水平,结果显示,与MOCK组相比,PPV感染组中各时间点的CCT5 m RNA和蛋白表达水平无显著变化(P>0.05)。设计并合成3个靶向cct5基因的特异性si RNA,转染PK-15细胞24 h后,q PCR和western blotting检测发现,与对照组相比,si-cct5-1能极显著抑制CCT5 m RNA和蛋白表达(P<0.01)。si-cct5-1转染PK-15细胞24 h后,以1 MOI PPV感染细胞24 h,q PCR检测发现,与对照组相比,si-cct5-1组PPV DNA拷贝数极显著降低(P<0.01)。进一步构建cct5基因敲除细胞系PK-15cct5-/-和过表达细胞系PK-15cct5,细胞活性检测结果显示,cct5基因的敲除和过表达对PK-15细胞生长活性无显著影响(P>0.05)。以1 MOI PPV感染细胞24 h,检测病毒DNA拷贝数、TCID50和NS1表达水平,结果显示,与对照组相比,PK-15cct5-/-组的病毒DNA拷贝数、TCID50和NS1表达水平均极显著降低(P<0.01),PK-15cct5组的病毒DNA拷贝数、TCID50和NS1表达水平均显著升高(P<0.05)。3.NS1 N端互作位点(36-42 aa)的突变引起病毒复制水平下降构建p CI-Flag-CCT5真核表达载体,分别与p GFP-NS1(1-185 aa)、p GFP-NS1(169-275 aa)、p GFP-NS1(266-552 aa)和p GFP-NS1(548-662 aa)共转染PK-15细胞24 h,激光共聚焦检测结果显示,CCT5与NS1(1-185 aa)在细胞核存在共定位,而与NS1其他3个截短体未发现共定位;将p GFP-NS1(1-185 aa)进一步截短的p GFP-NS1(1-43 aa)、p GFP-NS1(44-86 aa)和p GFP-NS1(87-185 aa)分别与p CI-Flag-CCT5共转染PK-15细胞24 h,激光共聚焦检测结果显示,CCT5与NS1(1-43 aa)存在共定位,而与NS1(44-86 aa)和NS1(87-185 aa)未发现共定位。Co-IP试验结果显示,CCT5与NS1(1-43 aa)互作,而不与NS1(44-86 aa)和NS1(87-185 aa)互作。通过比对PPV与其它细小病毒NS1的1-43 aa序列,选择保守的NS1 25-31 aa和36-42 aa进行突变,构建突变表达载体并分别命名为p GFP-NS1mut1和p GFP-NS1mut2。将p GFP-NS1mut1和p GFP-NS1mut2与p CI-Flag-CCT5共转染PK-15细胞24 h,激光共聚焦结果显示,CCT5与NS1mut1存在共定位,与NS1mut2不存在共定位;Co-IP试验结果显示,CCT5与NS1mut1存在互作,与NS1mut2不存在互作。以PPV感染性克隆为模板,构建NS1 36-42 aa突变PPV,命名为PPVmut。将PPVmut和野生型PPV分别以1 MOI感染PK-15细胞24 h后,检测病毒DNA拷贝数、TCID50和NS1表达水平,结果显示,与野生型PPV相比,PPVmut感染细胞中的病毒DNA拷贝数和TCID50显著降低(P<0.05),NS1表达水平极显著降低(P<0.01)。本研究成功筛选到PPV NS1的互作宿主蛋白CCT5,干扰、敲除和过表达cct5基因发现对PPV复制有显著影响;进一步确定了NS1与CCT5互作位点是NS1 N端36-42 aa,构建并获得了互作位点突变的毒株PPVmut,发现其复制水平显著降低。研究结果为进一步阐明PPV复制机制奠定了理论基础。