【摘 要】
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微小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）属隐孢子虫科（Cryptosporididae）隐孢子虫属（Cryptosporidium）的寄生性原虫,广泛寄生于人和多种哺乳动物体内,可造成免疫力低下及免疫功能障碍宿主严重的腹泻,甚至危及生命,但目前尚无有效的治疗药物。毒力因子在隐孢子虫的黏附、定植、侵袭以及逃避宿主免疫中发挥着重要作用,可能是引起隐孢子虫感染的重要原因之一。在顶复门
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目（编号:32072890）； 国家重点研发计划（编号:2017YFD0501305）； 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学实验室开放基金（编号:SKLVEB2020KFKT015）；
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微小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）属隐孢子虫科（Cryptosporididae）隐孢子虫属（Cryptosporidium）的寄生性原虫,广泛寄生于人和多种哺乳动物体内,可造成免疫力低下及免疫功能障碍宿主严重的腹泻,甚至危及生命,但目前尚无有效的治疗药物。毒力因子在隐孢子虫的黏附、定植、侵袭以及逃避宿主免疫中发挥着重要作用,可能是引起隐孢子虫感染的重要原因之一。在顶复门原虫众多的毒力因子中,钙调蛋白（calmodulin,Ca M）被认为是一种钙依赖的酶活性调节蛋白,对于顶复门原虫的生长发育具有重要作用,特别是在虫体入侵宿主细胞过程中,Ca M可通过调节Ca2+信号协助虫体入侵。自噬相关蛋白8（autophagy associated protein 8,ATG8）是引起细胞自噬的重要蛋白,当虫体处于营养缺乏、药物刺激等压力条件下时,可通过启动自噬维持自身营养需要,对于顶复门原虫的生存也至关重要。但是,目前关于Ca M和ATG8在C.parvum感染宿主机制中的研究鲜有报道。基于此,本研究在C.parvum转录组测序和蛋白质定性分析的基础上,原核表达了C.parvum Ca M和ATG8重组蛋白,并对其功能进行了初步研究,获得了如下结果:（1）C.parvum转录组测序和蛋白质定性分析:对本研究中犊牛传代的隐孢子虫卵囊进行亚型鉴定发现其为C.parvum IId A19G1亚型卵囊;对该卵囊进行转录组测序发现,该隐孢子虫卵囊含有3805个基因,编码3805个蛋白,GO分析共富集到4431条信号通路,其中蛋白磷酸化、DNA结合等被显著富集,KEGG分析共富集到207条信号通路,其中多巴胺能神经突触、神经营养素信号通路等被显著富集;蛋白质定性分析发现该隐孢子虫卵囊含有675个蛋白,GO分析共富集到1136条信号通路,其中肽生物合成过程、结构分子活性等被显著富集,KEGG分析共富集到56条信号通路,其中RNA转运、丙氨酸代谢障碍等被显著富集;转录组测序和蛋白质定性分析共有蛋白248个,这些蛋白存在于丙酮酸代谢、RNA降解等信号通路中。（2）Ca M的序列分析、原核表达及功能初步研究:对C.parvum卵囊转录组和蛋白质定性分析中共有的Ca M蛋白基因进行序列分析发现,该蛋白不含信号肽和跨膜区,其三级结构中存在两个手性结构域。对该Ca M蛋白进行原核表达,发现重组Ca M在上清液中表达,分子量为26 k Da,利用镍柱对重组Ca M进行纯化,并将纯化后的蛋白免疫家兔制备出Ca M中和抗体,其效价达到1:100000。实时荧光定量PCR发现,当C.parvum感染HCT-8细胞后6 h、8 h、12 h时,虫体中的Ca M表达水平均显著低于未感染细胞的虫体卵囊,但在感染后24 h,Ca M表达水平开始上升,在36 h时表达水平达到峰值并显著高于卵囊,随后开始下降,至48 h时其表达水平又显著低于卵囊;间接免疫荧光试验发现,Ca M主要定位于子孢子中部,感染细胞后主要分布于虫体细胞核周围;多抗血清中和试验发现,Ca M多抗血清在1:100稀释时对C.parvum入侵的最大中和效率达到30.69%,提示Ca M可能参与C.parvum入侵宿主细胞的过程。（3）ATG8的序列分析、原核表达及功能初步研究:对仅存在于C.parvum卵囊转录组中的ATG8蛋白基因进行序列分析发现,该蛋白不含信号肽和跨膜区,其三级结构为一松散的球状蛋白。对该ATG8蛋白进行原核表达,发现重组ATG8在包涵体中表达,分子量为14 k Da,利用镍柱对重组ATG8进行纯化,并将纯化后的蛋白免疫家兔并制备出ATG8中和抗体,其效价达到1:100000。实时荧光定量PCR方法发现,C.parvum在感染HCT-8细胞后虫体的ATG8表达水平逐步上升,12 h时表达水平达到峰值并显著高于卵囊,随后开始下降,至24 h、36 h和48 h其表达水平均显著低于卵囊;间接免疫荧光试验发现,ATG8分布于子孢子的整个细胞质,感染细胞后主要分布于虫体细胞核周围;多抗血清中和试验发现,ATG8多抗血清在1:200稀释时对C.parvum入侵的最大的中和效率为8.24%。综上所述,本研究对C.parvum卵囊进行了转录组测序和蛋白质定性分析,并在此基础上选择Ca M和ATG8进行了原核表达,并对蛋白的表达、定位和对虫体入侵的中和效率进行了研究,发现Ca M在C.parvum卵囊感染后早期表达水平下降后期上升,而ATG8在感染后早期表达水平上升后期下降;Ca M主要分布于子孢子中部,而ATG8分布于子孢子整个细胞质,感染细胞后Ca M和ATG8均主要分布于虫体的细胞核周围;Ca M和ATG8多抗血清对于C.parvum入侵的最大中和效率分别为30.69%和8.24%。研究结果深化了钙调蛋白和自噬相关蛋白对C.parvum感染影响的理解,为进一步阐明C.parvum的入侵机制和致病机理奠定了理论基础,同时也为隐孢子虫病疫苗设计和药物研发提供了新思路。
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