NIH（National Instituents of Health）shift是酶催化苯环上羟基化反应时引起的一种基团分子内迁移的现象,该现象在哺乳动物的疾病、药物代谢、抗生素合成以及芳香化合物的降解中均有发现。可以发生NIH shift的基团包括氢原子、卤素、乙酸、烷基以及羧基等。其中,氢原子和乙酸基团的迁移是由单个加氧酶催化完成,并有相关基因和酶学的报道,但其它基团包括羧基等的机理尚未阐明。羧基的分子内迁移主要发现于微生物的对羟基苯甲酸（para-hydroxybenzoate,PHB）有氧分解代谢中。PHB主要通过木质素的降解被释放到环境中,其与植物病原菌的致病性有一定的关系,并且可以作为碳源被自然界中的许多微生物所利用。迄今为止,PHB的微生物代谢研究已经取得了很多进展,其有氧代谢主要包括原儿茶酸和对苯二醌途径,此外还包括涉及羧基分子内迁移的龙胆酸（2,5-二羟基苯甲酸,gentisate,GA）途径。前两条代谢途径的分子机制已经研究清楚,但微生物通过GA代谢PHB的途径从发现到现在的42年时间里,依然没有基因和酶学等相关报道。Brevibacillus laterosporus PHB-7a通过龙胆酸分解代谢PHB,本文在酶学与分子生物学水平研究了该菌株中PHB到龙胆酸代谢中与羧基分子内迁移有关的机制,并对中间产物进行了鉴定和分析,详细阐述了一种新颖的迁移机制和一条“弃简从繁”的PHB-GA代谢途径。同时对后续的龙胆酸代谢基因簇也进行了详细的研究。首先,通过基因组测序和生物信息学分析,发现了菌株PHB-7a中龙胆酸代谢基因簇（bagXILK）。对基因簇中的四个基因分别进行了异源表达,并对BagI、BagL、BagK进行了纯化。这四个蛋白的功能验证结果表明BagX、BagI、BagL和BagK分别为间羟基苯甲酸6-羟化酶（meta-hydroxybenzoate（MHB）6-hydroxylase）、龙胆酸1,2-双加氧酶（gentisate 1,2-dioxygenase,GDO）,依赖于L-半胱氨酸（L-cys）的顺丁烯二酸单酰丙酮酸丙酮酸异构酶（maleylpyruvate isomerase,MPI）和反丁烯二酸单酰丙酮酸水解酶（fumarylpyruvate hydrolase,FPH）,比活力分别为1.34 U mg-1（底物:MHB）、5.54 U mg-1（底物:GA）、1.98U mg-1（底物:MP）和2.98 U mg-1（底物:FP）。该实验证明了该菌中存在完整的龙胆酸代谢基因簇,并通过异构途径进入三羧酸循环。其次,菌株PHB-7a全细胞转化PHB的实验证明负责转化PHB至GA的基因为诱导型表达。利用转录组测序技术和基因差异性表达分析,找到了负责将PHB转化为GA的基因簇（phgABC）。异源表达phgABC的全细胞转化实验证明PhgABC可以将PHB转化为GA。以稳定性同位素标记的PHB(2,3,5,6-tetradeutero-PHB and[carboxyl-13C]-PHB)作为转化底物,通过对产物GA的制备及其所含同位素的分析,证明了PHB的羧基分子内的迁移和保留,苯环上原有羧基从C1位迁移到了C2位,在这个过程中,三个基因phgABC缺一不可。本实验第一次从基因水平证实了羧基分子内迁移的现象。最后,将基因簇phgABC中的基因分别进行了异源表达和纯化,在化学合成了中间产物对羟基苯甲酰辅酶A（p-hydroxybenzoyl-CoA）之后,分别对这三个蛋白的功能进行验证,并详细测定了PhgA的酶动力学参数。PhgA,PhgB,PhgC分别为对羟基苯甲酰辅酶A羟化酶（p-hydroxybenzoyl-CoA hydroxylase）,龙胆酰辅酶A硫脂酶（gentisyl-CoA thioesterase）,对羟基苯甲酰辅酶A连接酶（p-hydroxybenzoyl-CoA ligase）。在这三个酶的顺序催化作用下,通过硫酯化合物的形成、苯环羟基化和硫酯键的水解这三步反应,将PHB转化为GA,最终完成羧基的分子内迁移,第一次从酶学水平详细阐述了羧基分子内迁移的每一步反应,揭示了PHB中羧基分子内迁移的本质其实是p-hydroxybenzoyl-CoA羟基化反应时引起的酰基辅酶A（acyl-CoA）的迁移。通过生物信息学分析发现,对于目前已完成测序的菌株,基因簇phgABC只存在于芽孢杆菌中,并且菌株PHB-7a可能是通过基因水平转移的方式从另一株芽孢杆菌Bacillus butanolivorans AFS003229中获得phgABC。本文发现的羧基分子内迁移的模式与已知的氢原子和乙酸基团的迁移完全不同,后两者均是在单个加氧酶的作用下完成,并且不涉及硫酯化合物的生成。羧基分子内迁移模式的发现揭示了硫酯化合物在生物化学过程中新的作用,也揭示了微生物代谢芳香化合物的多样性。