小胶质细胞是在中枢神经系统（Central nervous system,CNS）定居的固有免疫细胞,占脑内胶质细胞总数的10-20%。小胶质细胞参与监测和调节神经元生存的内环境,并在CNS损伤、修复和发育过程中起至关重要的作用。细胞因子、自身死亡的细胞和外来入侵的病原体等,可以通过与小胶质细胞表面的受体结合,促使小胶质细胞活化,细胞形态发生改变,合成并释放大量的炎症因子和神经毒性物质,这些因子包括:肿瘤坏死因子α（Tumornecrosis factorα,TNF-α）、白细胞介素 1β（Interleukin-1β,IL-1β）,白细胞介素 6（Interleukin-6,IL-6）,前列腺素 E2（Prostaglandin E2,PGE2）、一氧化氮（Nitric oxide,NO）、活性氧簇（Reactive oxygen species,ROS）等。小胶质细胞的活化及其介导的中枢神经炎症反应参与了几乎所有中枢神经系统疾病发生、发展的各个阶段。除了释放致炎因子,小胶质细胞还应答其他脑内非神经系统来源的免疫细胞所释放的致炎信号,脑内肥大细胞就是其中的重要细胞。肥大细胞是机体固有免疫系统的一种多功能效应细胞。它在全身免疫反应等病理和生理过程中的作用已研究的较为深入,例如免疫球蛋白E（Immunoglobulin E,IgE）诱导的超敏反应。但是它在中枢神经系统中的作用了解甚少,近十余年脑内肥大细胞的生理及病理功能才逐渐被揭示。脑内肥大细胞一般位于丘脑、下丘脑、海马、硬脑膜、软脑膜、脉络丛等部位,其中丘脑是脑内肥大细胞分布的主要部位,大多数的肥大细胞位于血脑屏障周围。正常情况下,在血脑屏障周围存着少部分活性脱颗粒状态的肥大细胞,其释放的组胺、类胰蛋白酶等介质对维持正常的神经系统功能发挥了重要作用,如调节激素的分泌、情绪、感觉、认知等。同时,脑内肥大细胞也参与了神经免疫系统疾病的病理改变,如孤独症、帕金森氏病、阿尔兹海默病、多发性硬化症、脑缺血症等。由于肥大细胞主要位于血脑屏障的脑组织侧,能在第一时刻捕捉到血液中的免疫信号,甚至快过于小胶质细胞,并通过“预贮存”和“新合成”两种途径,持续激活,以胞吐方式脱颗粒释放组胺、类胰蛋白酶等介质,影响中枢免疫细胞,成为中枢炎症反应的起始者和催化剂。故有学者提出肥大细胞是中枢免疫系统的“感受器”和“效应器”。然而,脑内肥大细胞和中枢固有免疫细胞—小胶质细胞之间有何联系,脑内肥大细胞对小胶质细胞的活化是否有影响,尚无人探讨,需要深入研究。本研究工作的第一部分首先鉴定小胶质细胞上组胺四类受体亚型的表达,然后研究组胺在促进小胶质细胞活化中的作用机制以及信号通路;第二部分探讨肥大细胞脱颗粒对小胶质细胞活化的影响及其机制。目的:探讨组胺对小胶质细胞活化的影响及其作用机制。方法:1.使用Western blot、免疫荧光和流式细胞仪检测原代培养大鼠小胶质细胞上组胺四类受体亚型的表达。2.首先使用浓度分别为0.001、0.01、0.1和1 μg/ml的组胺（Histamine,His）刺激小胶质细胞24小时,采用流式细胞仪检测小胶质细胞上组胺四类受体亚型及活化标记物ED8的表达;免疫荧光检测小胶质细胞上ED8的表达;ELISA法检测细胞上清中炎症因子TNF-α和IL-6的表达。其次,使用浓度为0.1 μg/ml的组胺分别刺激小胶质细胞0.5、2、6和24小时,采用流式细胞仪检测小胶质细胞上组胺四类受体亚型的表达;ELISA法检测细胞上清中TNF-α和IL-6的表达。然后,在使用浓度为0.1 μg/ml的组胺刺激小胶质细胞前预先在培养基中分别给予组胺四类受体亚型的拮抗剂,采用ELISA法检测组胺刺激24小时后培养基上清中TNF-α和IL-6的表达;流式细胞仪检测组胺刺激30分钟后小胶质细胞线粒体膜电位的变化。3.使用浓度为0.1、1、10和100 μM的组胺四类受体亚型的激动剂分别刺激小胶质细胞24小时,采用ELISA法检测细胞上清中TNF-α和IL-6的表达。4.使用浓度为0.1 μg/ml的组胺分别刺激小胶质细胞15、30、60、120和240分钟,采用Western blot检测AKT以及MAPK信号通路磷酸化水平;然后,在前一步结果的基础上,在组胺刺激小胶质细胞前预先在培养基中给予组胺1受体（H1R）和组胺4受体（H4R）的拮抗剂,Western blot检测AKT以及MAPK通路磷酸化水平变化。在前一步结果的基础上,在组胺刺激小胶质细胞前预先在培养基中给予AKT和MAPK信号通路抑制剂,采用ELISA法检测细胞上清中TNF-α和IL-6的表达。5.在使用浓度为0.1 μg/ml的组胺刺激小胶质细胞前预先在培养基中分别给予AKT信号通路抑制剂、H1R和H4R受体拮抗剂以及NF-κB抑制剂,免疫荧光检测NF-κB（p65）的亚细胞定位,Western blot检测IκBα磷酸化水平变化,ELISA法检测细胞上清中TNF-α和IL-6的表达。结果:1.Western blot、免疫荧光和流式细胞仪检测均证实原代大鼠小胶质细胞有组胺四类受体亚型的表达。2.组胺可以促进小胶质细胞上H1R和H4R表达增加,呈剂量依赖性和时间依赖性;组胺呈剂量依赖性促进小胶质胞上活化标记物ED8的表达;组胺呈剂量依赖性和时间依赖性促进小胶质细胞分泌TNF-α和IL-6;H1R和H4R受体拮抗剂可以阻断组胺刺激小胶质细胞引起的TNF-α和IL-6分泌;单独使用组胺四类受体亚型的拮抗剂对小胶质细胞的活化无影响;组胺可以引起小胶质细胞线粒体膜电位受损,而H1R和H4R受体拮抗剂可以部分抑制组胺引起的线粒体膜电位受损。3.H1R和H4R的受体激动剂可以促进小胶质细胞活化分泌TNF-α和IL-6,并呈剂量依赖性,而预先给予H1R和H4R受体拮抗剂可以阻断TNF-α和IL-6的分泌。4.组胺可以引起小胶质细胞AKT、p38 MAPK和JNKMAPK信号通路的活化,而预先给予H1R和H4R受体拮抗剂可以抑制其活化;预先给予AKT、p38和JNK的抑制剂可以部分阻断组胺引起的小胶质细胞分泌TNF-α和IL-6。5.组胺引起小胶质细胞NF-κB（p65）转入核内,而AKT、H1R和H4R的拮抗剂可以阻断此效应;组胺引起小胶质细胞IκBα磷酸化增加,间接反映NF-κB（p65）转入核内,而AKT、H1R和H4R的拮抗剂可以部分阻断IκBα的磷酸化增加;NF-κB的抑制剂PDTC可以部分抑制组胺引起的小胶质细胞分泌TNF-α和IL-6。结论:（1）小胶质细胞表达组胺四类受体亚型。（2）组胺促进小胶质细胞上H1R和H4R表达上调。（3）组胺受体H1R和H4R激动剂可以呈剂量依赖性和时间依赖性促进小胶质细胞释放炎症因子TNF-α和IL-6。（4）组胺促进小胶质细胞活化并释放炎症因子TNF-α和IL-6。（5）组胺促进小胶质细胞释放炎症因子与其调节线粒体膜电位有关。（6）组胺促进小胶质细胞活化的信号通路为H1R/H4R—p38/JNK/AKT—NF-κB。目的:探讨脑内肥大细胞脱颗粒对小胶质细胞活化及中枢神经系统炎症的影响。方法:在老鼠下丘脑定位注射肥大细胞稳定剂色甘酸钠（Cromolyn,Cro）和/或者肥大细胞激活剂Compound 48/80（C48/80）。1.将SD大鼠分为6组:对照组、C48/80 组、C48/80+Cro 100μg 组、C48/80+Cro 200μg组、Cro 100μg组和Cro 200μg组。在脑内预先给予色甘酸钠（100μg或者200μg）或同等体积的生理盐水,30分钟后给予C48/80（2.5μg）或同等体积的生理盐水,再30分钟或24小时后处死老鼠,取材。采用甲苯胺蓝染色法检测下丘脑肥大细胞数量;免疫组化染色检测下丘脑肥大细胞类胰蛋白酶和小胶质细胞活化标记物Iba1;ELISA法检测下丘脑和皮层炎症因子 TNF-α 和 IL-6 的表达;Western blot 检测 p38、JNK、ERK 和 AKT的磷酸化水平;流式细胞仪检测小胶质细胞上组胺四类受体亚型、蛋白酶激活受体 2（Protease-activated receptor 2,PAR2）和 Toll 样受体 4（Toll-like receptor 4,TLR4）的表达。2.进一步对肥大细胞缺陷小鼠KitW-sh/W-sh以及对应的背景小鼠下丘脑定位注射C48/80（0.8μg）或者同等体积的生理盐水,30分钟后处死取材。免疫荧光染色检测小胶质细胞活化标记物Iba1。结果:1.肥大细胞激活剂C48/80可以激活并增加下丘脑区肥大细胞的数量,而脑内预先给予肥大细胞稳定剂色甘酸钠可以明显抑制肥大细胞活化的数量;C48/80明显促进小胶质细胞的活化,而预先给予色甘酸钠明显抑制小胶质细胞的活化;C48/80明显增加下丘脑区炎症因子TNF-α和IL-6的表达,而预先给予色甘酸钠明显抑制TNF-α和IL-6的表达;C48/80明显增加p38、JNK、ERK和AKT的磷酸化水平,而预先给予色甘酸钠可抑制其磷酸化水平;C48/80可增加小胶质细胞上H1R、H4R、PAR2和TLR4受体的表达,减少H2R和H3R受体的表达,而预先给予色甘酸钠可抑制此结果。2.背景小鼠下丘脑定位注射肥大细胞激活剂C48/80明显增加下丘脑区小胶质细胞活化数量,而在肥大细胞缺陷鼠KitW-sh/W-sh下丘脑定位注射C48/80对小胶质细胞活化无影响。结论:脑内肥大细胞脱颗粒可以激活小胶质细胞,并可能通过小胶质细胞的活化引起中枢神经系统炎症。目的:探讨肥大细胞株HMC-1活化对小胶质细胞活化的影响。方法:将肥大细胞株HMC-1和原代小胶质细胞间接和直接共培养。1.分别以浓度为1、101、102、103和104 nM的促肾上腺皮质激素释放激素（Corticotropin releasing hormone,CRH）刺激 HMC-1 肥大细胞 12、24、48和72小时,然后采用流式细胞仪检测肥大细胞活化标记物Fc受体;然.后选用100 nM的CRH刺激HMC-1肥大细胞12、24、48和72小时,ELISA法检测细胞上清中TNF-α和IL-6的表达。2.使用100 nM CRH或其对照PBS刺激HMC-1肥大细胞12、24、48和72小时,然后取HMC-1细胞上清孵育小胶质细胞12小时,采用流式细胞仪检测小胶质细胞活化标记物ED8;孵育小胶质细胞24小时后,采用免疫荧光检测小胶质细胞活化标记物ED8。3.首先,以100 nM的CRH分别孵育小胶质细胞12、24、48和72小时,ELISA检测细胞上清中TNF-α和IL-6的表达。其次,使用100 nM CRH或其对照PBS刺激HMC-1肥大细胞12、24、48和72小时,然后取HMC-1细胞上清孵育小胶质细胞24小时,ELISA检测小胶质细胞上清中TNF-α和IL-6的表达。最后,将小胶质细胞和HMC-1混合进行直接共培养,并经CRH或其对照PBS分别刺激12、24、48和72小时,ELISA检测共培养细胞上清中TNF-α和IL-6的表达。4.在使用CRH刺激48小时的HMC-1肥大细胞上清孵育小胶质细胞24小时之前,提前 30 分钟给予H1R、H2R、H3R、H4R、PAR2、neurokinin 1（NK-1）和TLR4受体拮抗剂,ELISA检测细胞上清中TNF-α和IL-6的表达。5.首先,使用100 nM CRH刺激HMC-1肥大细胞48小时,然后取HMC-1细胞上清分别孵育小胶质细胞15、30、60、120和240分钟,Western blot检测MAPK和AKT的磷酸化水平。然后,在使用HMC-1细胞上清孵育小胶质细胞之前30分钟,提前给予H1R、H2R、H3R、H4R、PAR2、NK-1和TLR4受体拮抗剂,Western blot检测MAPK和AKT的磷酸化水平。结果:1.CRH呈剂量依赖性和时间依赖性（大于24小时）增加Fc 阳性细胞数量,HMC-1肥大细胞活化数量增多,不同浓度的CRH刺激HMC-1肥大细胞12小时对HMC-1的活化没有影响。100 nM的CRH刺激HMC-1肥大细胞48和72小时后,分泌TNF-α和IL-6增加并呈时间依赖性。2.经100 nM的CRH刺激48和72小时的HMC-1细胞上清可以激活小胶质细胞,未经CRH刺激的以及CRH刺激只有12和24小时的HMC-1细胞上清对小胶质细胞的活化没有影响。3.100 nM的CRH孵育小胶质细胞,没有促进小胶质细胞分泌TNF-α和IL-6,孵育48和72小时反而减少小胶质细胞的基础分泌量。经100 nM的CRH刺激48和72小时的HMC-1细胞上清可以促进小胶质细胞释放TNF-α和IL-6,未经CRH刺激的以及CRH刺激只有12和24小时的HMC-1细胞上清对小胶质细胞释放TNF-α和IL-6没有影响。小胶质细胞和HMC-1直接共培养,经CRH刺激24、48和72小时的共培养细胞上清中TNF-α和IL-6的含量明显增加,而未经CRH刺激的共培养细胞上清中TNF-α和IL-6的含量没有变化;CRH刺激HMC-1肥大细胞48和72小时后,细胞上清中TNF-α和IL-6含量增加,而在有小胶质细胞的存在下,CRH刺激24、48和72小时后,可以引起共培养细胞上清中TNF-α和IL-6含量的大幅增加。4.在HMC-1细胞上清孵育小胶质细胞之前提前30分钟给予H1R、H4R、PAR2和TLR4受体拮抗剂可以部分阻断HMC-1细胞上清诱导的小胶质细胞释放TNF-α和IL-6,而H2R、H3R和NK-1受体拮抗剂对HMC-1诱导小胶质细胞释放TNF-α和IL-6没有影响。5.使用100 nM CRH刺激HMC-1肥大细胞48小时,然后取其细胞上清分别孵育小胶质细胞15、30、60、120和240分钟,Western blot检测发现,磷酸化ERK、磷酸化p38、磷酸化JNK和磷酸化AKT的表达分别在HMC-1细胞上清孵育后60、15、120和120分钟后达到高峰。TLR4受体拮抗剂可以降低ERK、p38、JNK和AKT的磷酸化水平,H1R和H4R受体拮抗剂可以降低p38、JNK和AKT的磷酸化水平,PAR2受体拮抗剂可以降低ERK、p38和AKT的磷酸化水平。结论:HMC-1肥大细胞可能通过H1R、H4R、PAR2和TLR4受体激活小胶质细胞并促进其释放TNF-α和IL-6,并与小胶质细胞MAPK和AKT信号通路的活化有关。