微管切割蛋白（Microtubule-severing proteins,MTSPs）是一组微管结合蛋白,能利用水解ATP释放的能量切割微管,在细胞分裂、胞质内物质运输、细胞迁移等与微管相关的细胞活动中发挥重要作用。目前,MTSPs在哺乳动物卵母细胞中还没有相关的研究。因此,我们检测了小鼠体外发育的卵母细胞中已知的七种微管切割蛋白表达量与定位。结果发现,与同家族其他蛋白相比,KL2是唯一在减数分裂Ⅰ中（meiosis Matephase Ⅰ,MI）期及减数分裂Ⅱ中（meiosis Matephase Ⅱ,MⅡ）期均定位在染色体上的MTSPs。由于MTSPs可以通过切割微管促进纺锤体组装,且减数分裂缺少中心体附近微管组织中心,我们猜测染色体上的KL2可能利用微管切割活性,促进染色体附近微管的分裂增长,从而增加纺锤体微管数量,促进纺锤体组装,保证减数分裂的正常进行。为证实我们的假设,我们设计了特异性siRNA将KL2敲降,发现缺少KL2的分裂中期卵母细胞出现明显的纺锤体微管密度降低以及微管-动粒错误连接,并由此导致减数分裂障碍与卵子受精异常。为进一步研究KL2功能的相关机制与调节,我们进行了以下实验:首先,Aurora B是已知可防止出现微管-动粒错误连接的关键因子,当抑制Auorora B时,KL2在细胞内散在分布而不能聚集在染色体,说明活性的Aurora B可能对KL2的染色体定位有重要影响。第二,我们用质谱分析的方法检测到p-eEF2K（磷酸化真核生物延长因子2激酶）与KL2存在相互作用,当两者中有一方在染色体上含量降低时,另一方在染色体上的聚集程度随之增强50%左右,这也暗示了 p-eEF2K可能与KL2竞争在染色体上的结合位点;而且,我们检测到两者均与组蛋白H3有相互作用,可能是两者结合染色体的靶点。第三,我们制备了 p-KL2（磷酸化KL2）抗体,并检测到p-KL2定位在纺锤体两极,当抑制Erk1/2时,p-KL2在纺锤体两极的含量出现降低,证明Erk1/2可能为催化KL2磷酸化的上游激酶。我们的研究第一次阐明了 KL2在卵母细胞减数分裂中的作用,而且发现了 KL2在染色体上的含量受多种激酶的调节。同时我们还发现,另一种微管切割蛋白Fidgetin在卵母细胞透明带上强烈聚集,这也明显区别于同家族其他成员。当用特异性siRNA将Fidgetin敲降时,卵母细胞出现明显的受精异常,表现为多精子入卵的比例明显增高。现有受精模式认为,当第一个精子穿过透明带而接触卵母细胞膜,先后激发皮质反应与透明带反应,引起卵膜与透明带的硬化,防止第二个精子穿过透明带。而由于首个精子穿透的过程需要一定时间（大于30分钟）,故此模型无法解释在首个精子穿透而透明带尚未硬化的过程中没有第二个精子穿入。由于Fidgetin聚集在透明带,而卵母细胞缺少Fidgetin时出现明显的多精子入卵现象,我们猜测Fidgetin可能利用其活性发挥防止多精子穿入的屏障作用。我们用质谱分析的方法检测到Fidgetin与几种透明带蛋白均有相互作用,并且实验发现,在受精初始阶段,透明带Fidgetin的多聚体明显增多,由于微管切割蛋白需构成六聚体形式才能发挥功能,所以该结果符合我们的猜测,即精子穿入透明带时激活该区域Fidgetin单体,使其形成六聚体而阻止第二个的精子穿入。另外,我们发现,Fidgetin的失活（磷酸化修饰）需要Erk1/2的调节,而Erk1/2又是精子顶体反应的关键酶;因此我们猜测,Fidgetin可能通过与精子竞争关键酶的方式,阻止第二个精子穿入透明带。本研究第一次探讨了 Fidgetin在卵母细胞受精中的作用,将可能对现有受精模式做出重要的补充与修正。ZP3（Zonapellucida 3）是哺乳动物卵母细胞透明带的主要成分之一,在卵母细胞的受精过程中,ZP3能识别与卵母细胞结合的精子,并且促进精子的顶体反应。因此ZP3在卵母细胞的正常受精过程中发挥着重要作用。而ZP3敲除的小鼠是完全不育的。除了已知的路径,ZP3影响小鼠生育是否有其他方面的机制?ZP3作为卵母细胞特异表达蛋白,在卵母细胞成熟方面是否发挥作用?目前还没有相关的报道。我们研究发现,ZP3在GV（germinal vesicle）期卵母细胞中强烈聚集在细胞核区,在发育过程中逐渐转移到透明带上。当用特异性siRNA将卵母细胞中的ZP3敲降时,卵母细胞出现明显的GVBD（germinal vesicle breakdown）发生的障碍,并由此导致排极体率的低下。GVBD发生是卵母细胞恢复减数分裂的标志,ZP3聚集在GV核区,敲降ZP3时影响GVBD率,可见ZP3对于卵母细胞成熟是十分必要的。然而ZP3是如何影响GVBD发生的呢?为探讨相关机制,我们用去除透明带的卵母细胞样品做了 ZP3的IP-质谱分析,检测到了Ptprk（Protein tyrosine phosphatase,receptor type K）、Aipll（Aryl hydrocarbon receptor-interacting protein-like 1）、Diaph2（Diaphanous related formin 2）等相互作用蛋白,并建立了一个解释ZP3如何影响GVBD发生的模型。我们进一步的研究发现,ZP3通过调节Akt蛋白的磷酸化、Lamin（核纤层蛋白）与核膜的结合以及Actin（肌动蛋白）骨架在细胞皮质区域的组装等多种途径共同促进GVBD的发生。本研究将有助于我们对ZP3在GVBD发生中作用的理解,也将对GVBD发生机制的研究提供新的思路和重要补充。