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A型流感病毒（Influenza A virus,IAV）是分节段的单股负链RNA囊膜病毒。流感病毒的季节性频发对人类的健康与经济的发展造成了很大的危害。IAV的快速进化、耐药毒株的出现以及疫苗效力有限等问题可能会造成IAV的大流行。H5亚型禽流感病毒已经导致数百人死亡,虽然这些病毒还未获得人与人之间高效传播的能力,但是H5亚型禽流感病毒仍是IAV大流行的潜在威胁。磷酸化和乙酰化修饰能调节转录、趋化、新陈代谢、细胞信号转导、应激反应、蛋白质水解、细胞凋亡以及神经元的发育等多个生物学过程。流感病毒编码蛋白的磷酸化和乙酰化可显著影响病毒的生命周期、干扰素（Interferon,IFN）介导的天然免疫应答和细胞周期等方面,可作为抗病毒研究的靶点。IAV病毒聚合酶参与病毒的转录和复制且在不同亚型中保守性较高,因此被认为是抗病毒药物的良好靶标。然而,目前已有的文献关于流感病毒蛋白磷酸化和乙酰化的研究主要集中在NP、NS1和M1蛋白中,对于流感病毒聚合酶亚基PB2和PA蛋白的研究较少。本研究以一株 H5N1 亚型 HPAIVA/chicken/Jiangsu/k0402/2010（CK10）作为研究对象,鉴定并筛选出了 CK10病毒中PB2、PB1、PA、NP、M1、M2、NS1、NEP、PB1-F2和PA-X等10个蛋白的83个磷酸化位点,其中63个为新鉴定位点。其中,PA S225磷酸化曾经在H1N1中也被报道过但未开展相关功能研究,PB2 S181磷酸化在本研究中被不同方法重复鉴定到。此外,本研究发现了 PB2的第一个乙酰化位点PB2K187。本研究通过对PB2 S181和PAS225进行磷酸化/去磷酸化模拟突变,对PB2 K187进行乙酰化/去乙酰化模拟突变,系统分析了磷酸化和乙酰化在病毒生物学特性和致病性中的作用及相关机制。1.质谱筛选和鉴定H5N1亚型禽流感病毒PA和PB2蛋白潜在磷酸化位点和乙酰化位点本研究以H5N1亚型禽流感病毒CK10毒株为研究对象,基于IP结合质谱法以及纯化的病毒粒子结合质谱法,系统鉴定了 PA和PB2蛋白的磷酸化和乙酰化位点。我们成功鉴定了流感病毒PB1、PB2、PA、NP、M1、M2、NS1和NEP等8个主要编码的蛋白以及辅助蛋白PB1-F2和PA-X的84个磷酸化位点,其中有63个是新鉴定位点。此外,我们还鉴定出了第一个PB2乙酰化位点K187。进一步分析发现,PA的S225磷酸化位点也被文献报道存在于H1N1亚型流感病毒中但尚未开展相关功能研究,而PB2 S181磷酸化在本研究中的IP结合质谱法以及纯化病毒粒子结合质谱法中均被鉴定到。此外,我们对这些位点处在的功能区进行了系统分析,发现PA蛋白的7个位点（S60、T173、T177、S184、S190、S194、S225、S280、S395、S405、T564、T567、T570）以及 PB2 蛋白的 S653、S181和K187在重要的功能结构区上。综上所述,本研究进一步丰富了流感病毒蛋白磷酸化和乙酰化位点数据库,为后续的机制研究奠定了基础。2.PB2 S181磷酸化和K187乙酰化修饰对H5N1亚型禽流感病毒生物学活性的影响及其机制前一章的研究发现了 PB2蛋白中被重复鉴定到的高度保守的磷酸化位点S181以及第一个被鉴定的PB2乙酰化位点K187。在本章中,我们以CK10为母本病毒（rPB2-WT）成功拯救出了 PB2 S181的模拟磷酸化/去磷酸化突变重组病毒以及K187模拟乙酰化突变重组病毒（rPB2-K187Q）。基于以上重组病毒,开展了系列实验。蛋白3D结构模拟分析表明,PB2 S181和K187模拟修饰突变并不会显著改变PB2蛋白的结构。体外复制结果表明,PB2 S181E显著降低重组病毒在哺乳动物细胞MDCK中的复制水平,但对病毒在禽源细胞DF1中复制水平无显著影响;而无论是在MDCK还是DF1细胞中,rPB2-S181A和rPB2-K187Q复制水平均与rPB2-WT相当。聚合酶活性结果表明,PB2 S181A显著增强病毒的聚合酶活性,而PB2 S181E、PB2 K187R和PB2 K187Q均显著抑制病毒的聚合酶活性。蛋白稳定性实验结果表明,野生型PB2的蛋白稳定性均要强于突变PB2蛋白。核聚集实验结果表明,野生型PB2蛋白入核和出核速度均较快,突变的S181E PB2和K181Q PB2的入核和出核速度均慢于野生型PB2蛋白,而S181A突变PB2蛋白入核速度慢于野生型PB2蛋白。小鼠致病性实验结果表明,PB2 S181E显著减弱病毒对小鼠的致病力和体内复制能力,削弱病毒的肺损伤能力,减弱IAV诱导的天然免疫相关细胞因子的应答;PB2 S181A减弱病毒对小鼠的致病性和体内复制能力而PB2K187Q增强病毒对小鼠的致病性和复制能力,增强IAV诱导的天然免疫相关细胞因子的应答。综上所述,PB2 S181E模拟磷酸化突变通过降低聚合酶活性、PB2蛋白稳定性、抑制PB2核质穿梭能力、减弱病毒诱导的细胞因子应答等机制,显著降低病毒体内外复制能力和对小鼠的致病力。因此,PB2 S181E模拟磷酸化表现出的抗病毒作用为后续抗病毒药物的研究提供了新的靶点。3.PA S225磷酸化修饰对H5N1亚型禽流感病毒生物学活性的影响及其机制在第一章的研究中发现了 PA蛋白的S225位点可以发生磷酸化,并且该位点的磷酸化曾经在H1N1亚型毒株中也被报道过,但PAS225磷酸化在流感病毒复制中的作用及其机制仍未可知。本研究采取模拟磷酸化和模拟去磷酸化突变的方法,以H5N1高致病性毒株CK10病毒为母本病毒（rPA-WT）,成功拯救出了该毒株的PA S225模拟模拟磷酸化/去磷酸化突变重组病毒（rPA-S225A和rPA-S225E）。基于以上重组病毒,开展了系列实验。蛋白3D结构模拟分析表明,PA S225A和PA S225E均显著改变PA蛋白的结构。体外复制实验结果表明,PA S225A显著抑制了病毒在哺乳动物源和禽源细胞中的复制,而PA S225E则促进病毒在Vero细胞早期复制但抑制病毒在DF1细胞的早期复制。聚合酶活性结果表明,PAS225A和S225E均显著减弱病毒的聚合酶活性。核聚集实验结果表明,与野生型PA蛋白相比,S225A突变PA蛋白虽然入核速度较快,但出核速度也快,而S225E突变的PA蛋白入核速度较慢但出核速度较快。小鼠致病性实验结果表明,PA S225A显著抑制病毒在小鼠中的复制能力和致病力,减弱病毒的肺损伤能力,下调IAV诱导的天然免疫应答相关细胞因子的表达;而PAS225E增强病毒在小鼠体内的复制能力和致病力,对病毒诱导的小鼠肺损伤无显著影响。综上所述,PA S225A模拟去磷酸化突变通过降低聚合酶活性、加快病毒核质穿梭等机制,显著降低病毒的体内外复制能力和对小鼠的致病力。因此,PAS225A模拟去磷酸化表现出的抗病毒作用为后续抗病毒药物研究提供了新的靶点。