论文部分内容阅读
目的:探究Rab蛋白特别是Rab8A蛋白对C2C12细胞内GLUT4转运的调控;验证C2C12细胞的胰岛素敏感性,优化转染条件,筛选与GLUT4有共定位的Rab蛋白,考察Rab蛋白在GLUT4转运过程中发挥的作用。方法:(1)用含10%胎牛血清的DMEM培养C2C12细胞,通过形态学观察其增殖状况,优化细胞的转染条件;(2)C2C12细胞用脂质体转染HA-GLUT4-mCherry,考察胰岛素的刺激对C2C12细胞内GLUT4转运的影响,确定C2C12细胞的胰岛素敏感性;(3)转染HA-GLUT4-GFP/mCherry与Rab-RFP/GFP,同时标记细胞内Rab蛋白与GLUT4蛋白,用TIRFM显微镜观察两者的共定位,筛选可能影响C2C12细胞内GLUT4转运的Rab蛋白;(4)GLUT4囊泡内环境是酸性,细胞外环境是中性的,当GLUT4囊泡与质膜发生融合,就会使对PH敏感的探针IRAP-PHluorin暴露到细胞外,发出荧光。细胞转染IRAP-PHluorin与Rab8A,利用TIRFM显微镜观察GLUT4囊泡融合瞬间Rab8A的作用。(5)细胞转染Myc-GLUT4-BFP与Rab8A-T22N、Rab8A-Q67L,24小时后,免疫荧光染色染细胞膜上的Myc蛋白,使用TIRFM显微镜观察Rab8A突变体对GLUT4转运效率的影响;(6)敲除Rab8A蛋白,利用Western blot检测敲除效率,优化蛋白敲除条件后,利用TIRFM显微镜观察Rab8A、Rab8A蛋白敲除和Rab8A蛋白敲除后重新转入三种状态下GLUT4的转运效率,确定Rab8A对C2C12细胞内GLUT4转运的作用。结果:(1)含10%胎牛血清的DMEM培养C2C12细胞,细胞呈梭形。消化后悬浮状态的细胞转染效率高于贴壁状态的细胞,且脂质体与质粒的比为5:1时转染效率最优;(2)在胰岛素刺激下,C2C12细胞内GLUT4转运效率明显高于对照组,提高约1.8倍;(3)同时转染带荧光标记的Rab蛋白与GLUT4后,在TIRFM显微镜下,Rab8A、Rab13、Rab14与GLUT4囊泡有大面积的重叠,Rab10、Rab11蛋白没有;(4)Rab8A出现在GLUT4囊泡与质膜的融合之前,并且随着GLUT4囊泡融合到质膜后囊泡的扩散而扩散;(5)Rab8A突变体对C2C12细胞内GLUT4的转运有不同的影响,过表达Rab8A-Q67L的细胞GLUT4的转运效率增强,而过表达Rab8A-T22N的细胞GLUT4的转运效率降低;(6)优化敲除效率,siRNA与RNA iMAX比例为4:1,蛋白敲除效率达到80%。敲除Rab8A蛋白后,细胞内GLUT4的转运受到了明显的抑制,重新转入Rab8A后,这个抑制作用被消除。结论:(1)C2C12成肌细胞体外增殖速度较快,转染条件确定为消化后悬浮状态的细胞,脂质体与质粒的比为5:1;(2)胰岛素的刺激可以促进C2C12细胞内GLUT4转运,C2C12细胞具有胰岛素敏感性,适合后续对该细胞的研究;(3)Rab8A、Rab13、Rab14与GLUT4有共定位,Rab10、Rab11蛋白没有;(4)Rab8A在GLUT4囊泡与质膜的融合过程中起作用;(5)Rab8A突变体对C2C12细胞内GLUT4的转运有不同的影响,Rab8A-Q67L促进GLUT4的转运,Rab8A-T22N抑制GLUT4的转运;(6)Rab8A-KD对GLUT4的转运有明显的抑制作用,重新转入Rab8A后,这个抑制作用会被消除。综上所述,Rab8A可以调控C2C12细胞内GLUT4的转运,且主要调控GLUT4与质膜的融合过程。