目的:党参多糖是党参（Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.）主要药效成分之一,具有增强免疫、抗胃溃疡等功效。潞党参为山西道地药材,党参多糖含量显著高于其他产地党参。道地药材道地性的形成具有逆境效应,受道地产区特殊生态环境的影响,而MYB转录因子家族大多可响应环境胁迫,从而调控植物次生代谢产物的形成。而关于MYB转录因子在党参多糖积累中的作用机制尚不明确。课题组前期通过对不同发育时期党参不同组织转录组分析,筛选得到与多糖合成相关的转录因子CpMYB14,本文利用时空表达分析、亚细胞定位、酵母单杂交技术以及基于党参愈伤组织遗传转化体系的过表达分析,阐明转录因子CpMYB14调控党参多糖合成的分子机制。方法:1.通过无缝克隆技术构建植物表达融和载体p CAMBIA3301-CpMYB14-e GFP,通过烟草叶片瞬时转化法将重组质粒导入烟草悬浮细胞中,利用激光共聚焦扫描显微镜分析CpMYB14蛋白的亚细胞定位。通过干旱及低温胁迫处理党参幼苗,结合q RT-PCR技术,分析胁迫条件下党参CpMYB14转录因子表达与果聚糖积累量的变化。2.通过无缝克隆技术将Cp1-SST基因启动子和CpMYB14基因分别构建到诱饵载体和猎物载体上,利用酵母单杂交技术对两者进行互作验证。3.基于GUS报告基因,构建农杆菌介导的党参茎段愈伤组织遗传转化体系。4.利用党参愈伤组织遗传转化体系对CpMYB14基因进行过表达分析,结合HPGPC及q RT-PCR技术,分析CpMYB14基因过表达对党参多糖合成的影响。结果:1.成功构建植物融和表达载体pCAMBIA3301-CpMYB14-e GFP,通过激光共聚焦显微镜观察,结果显示CpMYB14蛋白定位于细胞核。党参CpMYB14转录因子可以响应干旱及低温胁迫,并且党参果聚糖含量发生变化。2.酵母单杂交结果显示,在700 ng/ml Ab A浓度的SD/-Leu培养基中,携带CpMYB14基因的猎物载体与携带Cp1-SST基因启动子的诱饵菌株共转化后有单菌落生长,表明二者存在互作关系。3.以党参茎段为外植体,经预培养3 d,菌液浓度0.3,侵染15 min,共培养1 d后延迟培养12 d。在此条件下,经PCR鉴定和化学组织染色,发现该党参遗传转化体系转化率高于90%。4.通过qRT-PCR鉴定,获得阳性过表达愈伤组织。CpMYB14基因过表达后,果聚糖含量显著降低,党参多糖合成相关基因Cp1-SST表达量显著降低,Cp1-FEH、Cp6-FEH、CpSu Sy表达量显著增高。结论:1.构建了党参愈伤组织高效遗传转化体系:以党参茎段为外植体,经预培养3 d,菌液浓度0.3,侵染15 min,共培养1 d后延迟培养12 d。2.党参CpMYB14转录因子定位于细胞核中,可以响应干旱、低温胁迫,并与党参果聚糖合成关键酶基因Cp1-SST互作,并负向调控党参果聚糖合成,同时正向调控党参多糖合成相关基因Cp1-FEH、Cp6-FEH、CpSu Sy表达。