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慢性髓系白血病(CML)是以费城染色体(Philadelphia Chromosome, Ph-chromosome)为特征的多功能造血干细胞异常的恶性增生性疾病。费城染色体是由9号染色体和22号染色体相互异位而形成的,其结果产生的Bcr-Ab1融合基因可编码产生分子量为210kDa的Bcr-Abl融合蛋白,它具有异常增高的蛋白酪氨酸激酶活性,是CML发病的始发因素。CML的治疗方法包括放疗、化疗(马利兰、羟基脲、干扰素-α(IFN-α))及干细胞移植等,但这些治疗方法疗效欠佳且副作用较大。随着Bcr-Abl异常活跃的酪氨酸激酶活性被认识,其逐渐成为抗CML药物研究的分子靶点。伊马替尼(Imatinib)是首个用于肿瘤临床治疗的小分子靶向药物,因其能特异性作用于Bcr-Ab1酪氨酸激酶,以其显著的疗效及低毒副作用的特点,成为CML治疗的一线用药。目前临床应用Imatinib标准剂量为400mg/d,对于CML慢性期患者有效,但对进展期CML患者疗效较差,在治疗后数周或数月内复发或进展至急变期。另外,Imatinib不能根除残留的白血病干细胞及原始祖细胞,成为疾病复发的危险因素。因此寻找新靶点或多靶点治疗药物成为CML研究的热点。临床上常见的获得性Imatinib耐药机制主要分为两类：Bcr-Abl依赖型和Bcr-Ab1非依赖型。Bcr-Ab1依赖型耐药包括Bcr-Ab1激酶区域突变和Bcr-Ab1基因扩增导致Imatinib作用下降或丧失。Bcr-Abl非依赖型包括P糖蛋白(P-gp)的表达,使细胞内药物浓度下降：Imatinib与血浆中α1酸性糖蛋白结合而降低matinib在细胞内的浓度；另外,从Immatnib耐药的患者中分离的细胞中发现Src激酶家族(SFK)成员中Lyn和Hck过表达,提示SFK也涉及Bcr-Ab1非依赖型Imatinib耐药。由于Abl与SFK成员中具有明显的序列同源性及活性中心结构相似性,因此,在对多种不同化学结构的Src激酶抑制剂的研究中包括Bosutini、Dasatinib及AP24534等,发现这些化合物能够较Imatinib更有效地抑制Bcr-Ab1激酶活性,并且对多种位点突变的Bcr-Ab1有效。JIN系列化合物是一种新型的噻唑类衍生物,我们采用K562细胞和Ba/F3p210和p190细胞包括野生型及三株具有突变位点Y253F、T315I及E255K的细胞观察了21个JIN系列化合物对细胞增殖的影响。MTT结果显示,大多数JIN系列化合物对Ba/F3P210T315I无效,并且它们的综合药效均不如阳性化学物AP24534。对于耐药机制的研究方法除通过分析临床发生Imatinib耐药的患者样本所发生的改变以外,体外建立Imatinib耐药细胞系也是研究的重要途径。在前期研究中,本实验室建立了不同耐药阶段的人慢性髓系白血病细胞K562/Imatinib耐药细胞系：K562/G3.0、K562/G5.0、K562/G7.0,可分别稳定存活在含有3.0μmol·L-1、5.0μmol·-1和7.0μmol·L-1Imatinib药液的培养体系中。采用二维凝胶电泳(2-DE)的方法,通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析,已寻找到耐药株与亲本株之间的14个差异蛋白点,根据差异蛋白与肿瘤的密切关系以及相关文献报道,最终确定膜联蛋白A1(annexin A1, ANXA1)为研究对象,以探讨ANXA1是否介导或参与了Imatinib耐药的发生。ANXA1是一种细胞内源性骨架蛋白,本实验室前期研究中在体外建立的耐Imatinib的K562细胞中,ANXA1的表达会出现明显上调,且随耐药倍数的增加而增加。为了研究ANXA1是否参与了Imatinib的耐药,采用脂质体(Lipofectamine2000)转染的方法建立了空载体对照K562-pEGFP-N1和稳定过表达ANXA1的K562-pEGFP-N1-ANXA1细胞株。MTT、细胞增殖及细胞周期实验结果显示,稳定转染ANXA1的K562-pEGFP-N1-ANXA1细胞株对伊马替尼的敏感性增加,但增殖能力和细胞周期没有改变；Western Blot结果显示,K562-pEGFP-N1和K562-pEGFP-N1-ANXA1细胞株中的膜联蛋白A1家族蛋白、耐药相关蛋白以及细胞增殖和周期相关蛋白均无明显改变；免疫共沉淀结果显示,K562-pEGFP-N1-ANXA1细胞株中ANXA1与β-actin的相互作用明显增强。同时又建立了瞬时干扰ANXA1的K562细胞模型,MTT结果显示,瞬时干扰ANXA1后的K562细胞对伊马替尼的敏感度降低；Western Blot结果显示,瞬时干扰ANXA1后的K562细胞中耐药相关蛋白也无明显改变；免疫共沉淀结果显示,瞬时干扰ANXA1后的K562细胞中的ANXA1与β-actin的相互作用明显减弱。综上所述,Imatinib耐药是一个复杂的多因素作用的结果,不同的研究方法显示了不同的耐药机制。我们推测,本实验室在体外建立的ANXA1过表达的K562细胞株中,可能由于膜联蛋白A1的高表达及其与β-actin的相互作用促进了伊马替尼的吸收,从而增加K562细胞对伊马替尼的敏感度。