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目的利用生物信息学分析的方法,筛选出原头蚴阶段的特异性表达抗原中具有诊断潜质的肽段分子,为包虫病特异性诊断抗原的开发奠定基础。方法1.利用基因表达谱差异分析的方法筛选细粒棘球绦虫原头蚴特异性表达的分子:(1)通过对互联网NCBI网站genome数据库上中国国家南方基因组研究中心公布的细粒棘球绦虫基因组中原头蚴与六钩蚴基因表达谱的数据进行比较分析,筛选出二者差异表达的基因。依据饱和度值(Reads)和表达丰度(RPKM),筛选出在六钩蚴阶段不表达(Reads=0、RPKM=0),而在原头蚴阶段高表达(Reads>20、RPKM>0)的差异分子。(2)应用Uniprot在线蛋白质数据库的文献注释,对筛选出的差异分子进行亚细胞学定位分析,筛选在膜表面表达或分泌型蛋白作为诊断抗原的候选分子。2.血清模型的制备:空白组小鼠血清,不作任何处理;佐剂对照组小鼠血清,用弗氏佐剂免疫小鼠获得;原头蚴感染组小鼠血清,用获取的原头蚴标本直接感染小鼠获得;原头蚴粗抗原免疫组血清,将原头蚴标本处理后免疫小鼠获得;候选分子蛋白免疫组小鼠血清:构建候选分子的基因工程菌株,表达其重组蛋白后免疫小鼠获得。3.候选分子的免疫特性分析:以上述血清模型为基础,采用Western-blot方法鉴定诊断抗原候选分子的免疫学特性,采用ELISA方法分析候选分子的血清识别效果。4.差异分子抗原表位的生物信息学预测分析及表位多肽的合成与鉴定:(1)利用在线预测分析网站ABCpred、IEDB、BepiPred-1.0交叉分析并筛选候选分子的B细胞表位抗原,利用DNAstar软件综合预测分析候选分子二级结构,综合以上生物学信息获取多个具有抗原潜力的表位多肽序列。(2)将筛选的表位多肽委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行人工合成,并且利用高效液相色谱技术(HPLC)和质谱技术(MS)对合成多肽进行质量鉴定。5.表位多肽的免疫学特性分析及筛选:利用ELISA方法,以不同血清模型对合成的所有表位多肽进行识别,分析并筛选出能够同时识别原头蚴感染组和候选差异分子重组蛋白免疫组的肽段,此外,对筛选出的表位多肽进行初步的血清特异性验证。结果1.通过对细粒棘球绦虫原头蚴和六钩蚴阶段mRNA分子表达谱的差异比较分析,从7825个差异分子中筛选出在六钩蚴阶段不表达,而原头蚴阶段高表达的分子共计356个,亚细胞定位分析后找出在膜表面表达或分泌型蛋白16个,去除序列长度过长的以及过短的5个分子,最终剩余11个候选分子,利用随机数字表法选择其中2个分子作为最终的候选诊断抗原分子,具体为Eg-07112、Eg-07279。2.利用制备的血清模型对候选分子进行鉴定,Western-blot结果显示,重组蛋白rEg-07112不识别空白组、佐剂对照组小鼠血清,与原头蚴粗抗原免疫组、原头蚴感染组、rEg-07112蛋白免疫组小鼠血清均能识别;重组蛋白rEg-07279不识别空白组、佐剂对照组小鼠血清,与原头蚴粗抗原免疫组、原头蚴感染组、rEg-07279蛋白免疫组小鼠血清均能识别。ELISA结果显示rEg-07112、rEg-07112均能识别原头蚴感染小鼠血清、原头蚴粗抗原免疫小鼠血清及其完整蛋白免疫后小鼠血清,且识别能力由强到弱依次为完整蛋白免疫后小鼠血清、原头蚴感染小鼠血清、原头蚴粗抗原免疫小鼠血清。3.利用B细胞表位在线预测网站ABCpred、IEDB、BepiPred-1.0结合DNAstar软件综合分析Eg-07112、Eg-07279蛋白质氨基酸序列,最终筛选获得9条Eg-07112抗原表位多肽,9条Eg-07279抗原表位多肽,共计18条多肽。通过高效液相色谱技术(HPLC)对合成的多肽进行纯度分析,结果显示,多肽纯度均在98%以上(98.030%-99.556%)。通过质谱技术(MS)对合成多肽进行分子鉴定,结果显示,合成多肽的分子量均与预期一致,提示合成的多肽质量较为稳定、可靠。4.利用ELISA方法对合成表位多肽进行血清模型识别,将表位多肽的原头蚴感染组和Eg07112、Eg07279蛋白免疫组S/Co均设置为≥2.0时,最终筛选出2条多肽,具体序列为Eg-07112(275-PNPWAPPQQQTETT-288)、Eg-07279(468-SDASKKPATYNPDAYP-483),在小范围血清模型内,显示具有较好的特异性。结论1.通过生物信息分析筛选出的差异分子Eg-07112、Eg07279具有成为细粒棘球绦虫特异性诊断抗原分子的潜力。2.抗原表位Eg-07112(275-PNPWAPPQQQTETT-288)、Eg-07279(468-SDASKKPATYNPDAYP-483)具有成为细粒棘球绦虫特异性诊断抗原分子的潜力,且识别血清优势强于完整蛋白分子。