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研究背景:肥胖及其相关伴发症已成为世界性健康问题,它和环境、遗传、行为及心理等多因素有关。近年来对肥胖基础研究已深入分子水平,其中Mi croRNA(miRNA)在肥胖过程中的相关作用受到广泛重视。miRNA是一类长度约22nt内源性非编码功能性RNA,通过与靶mRNA的特定序列完全或不完全互补结合,诱导靶mRNA降解或者阻止其翻译。目前相关研究表明miRNA在肥胖过程中脂肪细胞分化、脂质代谢、胰岛素抵抗等环节起到重要调节作用,并与Ghrelin、Leptin等激素水平相关。因此以miRNA作为新的切入点,为肥胖症病因、预测及基因治疗等研究开辟了新的途径。
目的:检测肥胖症患者胃组织miRNA表达谱,筛选并验证其与健康者差异表达的miRNAs,探寻可能与肥胖相关的miRNAs。
方法:应用微阵列芯片技术筛选出肥胖组胃组织中差异表达的micRNA,并从中选择miR-126、miR-141、miR-194、miR-99a、miR-200a进一步行定量PCR验证。收集8例行腹腔镜袖套式胃大部切除术治疗的肥胖症患者(BMI>30 kg/m2)及8例行胃镜检查的健康志愿者(BMI<30 kg/m2)胃组织标本。按照Agilents miRNAComplete Labeling and Hyb Kit(Agilent Technologies,Inc.2010,Version2.3)试剂盒说明进行标记及芯片杂交,杂交结束后用Agilent G2505C微阵列芯片扫描仪进行扫描。用Target Scan Release4.2 algorithm法预测差异表达micRNA的靶基因。
在芯片扫描基础上,选择miR-126、miR-141、miR-194、miR-99a、miR-200a行定量PCR验证。提取上述8例肥胖症患者及8例健康志愿者胃组织标本miRNA,按miScriptⅡ Reverse Transcription Kit(购自Qiagen公司)合成cDNA,用LC480Ⅱ型荧光定量PCR仪进行实时定量RT-PCR,所得数据采用2-△△Ct法进行分析。
结果:微阵列芯片结果显示:与正常胃组织相比,肥胖者胃组织异常表达(FC>2,P<0.05)的miRNA总共有203个,其中上调128个,下调75个。有18个micRNA与BMI呈相关关系(miR-222、194、192、200c、215、126、501-3p、451、665、126*、625、UL70-3p、648、452、K12-3、223、1260与之呈正相关,140-3p、33b*与之呈负相关)。
荧光定量PCR结果显示:肥胖组胃组织中5个miRNA相对表达显著低于非肥胖组值,其2-△△Ct值分别为miR-126(0.1120)、miR-141(0.0135)、miR-194(0.0016)、miR-99a(0.3697)、miR-200a(0.0038)。其中miR-141、miR-194、miR-200a结果具有统计学意义。
结论:
1、肥胖症患者胃组织miRNA表达发生显著改变。与非肥胖组相比,表达上调大于2.0倍的miRNAs有128个,下调大于2.0倍的miRNAs有75个。其中19个micRNA与BMI呈相关关系(miR-222、194、192、200c、215、126、501-3p、451、665、126*、625、UL70-3p、648、452、K12-3、223、1260呈正相关,140-3p、33b*呈负相关)。
2、肥胖症胃组织中miR-141、miR-194、miR-200a差异表达可能起到调控肥胖的作用。
3、miRNA芯片是同时大规模筛选肥胖胃组织miRNAs差异表达的有效方法。