目的:原发性肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是全世界常见的恶性肿瘤之一，死亡率较高，而且近年来发病率呈上升趋势。射频消融（Radiofrequency ablation，RFA）治疗原发性肝癌是近年来被医学界接受和应用的一项微创治疗技术，继手术治疗、介入治疗以后被认为是肝癌的第三大治疗方法。大量研究已初步表明射频较其他局部微创治疗方式更为安全、有效。然而，射频治疗受多种因素包括技术原因、肿瘤体积偏大或肿瘤位置特殊、“热沉效应”等影响，容易发生消融不完全，及早及时发现治疗后肿瘤残存，对肝癌的后续治疗至关重要。鉴于残癌与炎性反应带混杂，均表现为富血供病变，常规CT、MRI增强扫描结合形态学分析难以进行鉴别，而且炎性反应带存在时间约1-6个月，所以局部肿瘤残余或复发的检出往往需要每3到6个月定期影像随访。残癌早期的准确诊断是亟待解决的难题，需要更精确、更灵敏的影像学方法作出准确评价，相关研究成为国内外医学界关注的热点和难点。　　 近年来，随着影像设备、技术的迅速发展和扫描序列的不断完善，人们已不满足于常规解剖图像的分析，开始进行病变功能状态的影像学相关研究探讨，包括双源Flash CT灌注成像、能谱分析及MRI弥散成像、波谱成像、动态增强检查等，可以无创性地了解肝脏病灶的代谢、能量及血流等的变化，因而功能影像学手段在肝脏显像中的不断发展对评价肝癌射频治疗后的疗效及预后有着深远的意义。国外研究已经证实双能CT功能影像对孤立肺结节、甲状腺结节及肾上腺结节等的诊断及鉴别诊断具有重大价值，在RFA后残癌诊断及早期鉴别诊断中的功能影像疗效综合评估的相关研究未见报道。随着功能影像技术的不断发展与成熟，RFA后残癌早期的准确诊断这一难题有望得以解决。　　 本实验通过建立一种微创、较简易、便于推广应用且稳定的兔VX2改良肝癌模型及射频热凝后残癌的动物模型，应用多种功能影像新技术，结合免疫组化指标对射频消融后残癌的生物学行为进行评价，比较不同影像技术对射频消融后的不同时间点残癌与治疗炎症反应带之间的参数值的差异和诊断效能，旨在初步探讨CT、MRI功能影像学在残癌的早期准确诊断中的应用价值，以及反映残癌组织生物学行为的实用意义，以了解射频治疗肝癌的分子机制，为临床肝癌射频后续治疗提供理论依据。　　 方法:　　 1.兔VX2肝癌改良模型、射频消融后残余瘤模型的建立分别采用CT引导下经皮种植瘤组织块及开腹瘤组织块种植的方式制作兔VX2肝癌模型，比较二者成瘤的差异，确立优选的兔VX2改良肝癌模型。在此基础上，应用冷极射频肿瘤治疗机，毁损半径约为肿瘤2/3最大半径，基本射频参数为40V、70℃、2min，冷水泵设定流速15-25 ml/min，构建射频热凝后残癌的动物模型。　　 2.射频消融热凝术后疗效评估的双能CT功能影像学实验研究应用残余肝癌模型54只，其中30只分成5组:每组6只，分别于RFA术前、术后3天、7天、14天、21天行双能CT灌注检查;余下24只分成4组:每组6只，分别于RFA术后3天、7天、14天、21天行双能CT能谱成像包括碘含量测量及能谱曲线检查。检查后由两名多年诊断工作经验的副主任医师应用盲法勾画感兴趣区进行图像分析，并于不同时间点处死瘤兔与病理学对照，分析各功能影像方法的诊断效能和限度。　　 双源Flash CT灌注扫描采用的最大斜率法和Patlak肿瘤灌注模型进行往返同层动态扫描。扫描后分析RFA后不同时间点残癌及炎症反应的各灌注参数值的差异。采用免疫组织化学PV二步法检测兔肝脏病灶中VEGF、MVD(CD34)水平，分析灌注参数值与VEGF、MVD的相关性及RFA对残癌组织血管生成的影响。　　 双源Flash CT碘含量图像分析中，先构建体膜研究碘含量测量方法的可行性。将含碘对比剂溶液用蒸馏水配成10种不同浓度(mg/ml)于15毫升硬塑料管体模中，浓度依次为0，0.5，1.0，1.5，2.0，3.0，4.0，5.0，8.0，10.0，行双能扫描后得到碘含量分布图，分析体模各测量值与真实值之间的差异，并做相关分析评价其可靠性。随后对残癌模型不同时间点行双能多期增强扫描，扫描时相:注射造影剂后15s、27s和50s，得到动脉期、静脉期、平衡期的不同管电压下以及融合图像。划定感兴趣区的方法分别在各期残癌、炎症反应及腹主动脉进行碘含量测定，计算碘浓度值及标准碘浓度值，定量分析残癌及炎症反应带二者区别。并将实验兔双能量扫描数据传入能谱分析软件，得到不同Kev（40Kev-190Kev区间，每10个Kev为一间隔）下的单能量图像，测定不同Kev下各感兴趣区的CT值取平均值，绘制能谱曲线图，分析比较残癌及炎症反应的差异。　　 3.射频消融热凝术后疗效评估的MRI功能影像学实验研究应用残余肝癌模型40只，分成5组:每组8只，分别于RFA术前、术后3天、7天、14天、21天行双能CT灌注检查;余下24只分成4组:每组6只，分别于RFA术后3天、7天、14天、21天采用Magnetom Avanto1.5T行MR功能检查（包括DWI、MRS及DCE-MRI序列）后处死并病理学观察对照，分析各功能方法的诊断效能和限度。　　 MRI弥散加权成像采用EPI—diff fast—DWI序列采集成像，每次成像均选用4个b值，分别为0、200、600、1000 s/mm2。划定感兴趣区计算ADC值。分别计算各b值DWI图像中肿瘤的信噪比、肿瘤与正常肝脏间的信号强度比及对比噪声比，分析比较残癌及炎症反应的差异。MR动态增强(DCE-MRI)采用FL3D序列（快速小角度激发三维成像序列）加脂肪抑制技术，造影剂团注剂量0.2 mmol/kg，流速1 mL/s，层厚3mm，注射造影剂后第5s开始增强扫描，无间断扫描20次，单次扫描时间11s。收集数据后，绘制时间—信号强度曲线（SI-T曲线），按照形态分成持续上升型（Ⅰ型）、平台型（Ⅱ型）和流出型（Ⅲ型）3型。计算并比较两组峰值时间(Tmax)、强化程度(SIm％)、强化率(R)。采用免疫组织化学PV二步法检测兔肝脏病灶中VEGF、MVD(CD34)水平，分析灌注参数值与VEGF、MVD的相关性及RFA对残癌组织血管生成的影响。　　 1H-MRS检查采用单体素-激励回波探测法(SVS-STEAM序列)进行氢谱数据采集。分别测量治疗后不同ROI内主要代谢物如脂质(Lip)、胆碱(Cho)、乳酸(Lac)和肌酸(Cr)的峰值，Cho/Cr及Lip/Cr比值等，分析比较各时间点残癌及炎症反应的差异。　　 4.多种功能影像技术对残癌诊断的综合研究将ROC曲线得到的诊断阈值作为残癌和炎症反应的界值，将DWI、DCE-MRI、MRS及CT的灌注和能谱成像采用系列诊断试验进行两两联合，即两种检查方法均诊断残癌时则诊断结果定为残癌，否则，只要有一种方法诊断炎症反应则诊断定为炎症反应。以病理结果作为金标准，分别计算各影像手段及两两联合试验的诊断灵敏度、特异度。　　 结果:　　 1.兔VX2肝癌改良模型、射频消融后残余瘤模型的建立经皮CT引导法与开腹种瘤法成功率相近，分别为86％和79％(P＞0.05)，种植后第2周左右行CT及MRI扫描显示兔VX2肝种植瘤为富血供肿瘤，RFA后残癌及炎症反应带均呈明显强化，常规CT及MRI检查难以鉴别二者。CT引导经皮穿刺种植组与开腹种植组肿瘤在坏死率、分叶率方面比较无统计学差异(P＞0.05），CT引导经皮种植组粘连率显著减低，与开腹种植组比较有统计学意义(P=0.037,P＜0.05)。　　 2.射频消融热凝术后疗效评估的双能CT功能影像学实验研究兔肝VX2瘤冷极射频治疗后病灶随着时间的改变而其CT灌注表现各有不同。术后3d、7d内血流灌注伪彩图及TDC图二者无明显差异(P＞0.05）。术后第14d时灌注伪彩图及TDC图二者有差异;两组的BF、PMB比较P＜0.05。术后21d两组的BF、BV、PMB、ALP、HPI比较P＜0.05，统计学有差异。PVP均值差异无统计学意义(P＞0.05)。利用ROC曲线法对BF、PMB分析显示:BF曲线下面积0.92，当界值为43.01ml/min/100g时残癌诊断的灵敏度为80％、特异度为80％; PMB曲线下面积0.84，当界值为20.43 ml/min/100g时，残癌诊断的灵敏度为80％、特异度为60％。当同时满足BF＞43.01 ml/min/100g和PMB＞20.43ml/min/100g时，残癌诊断的灵敏度为64％、特异度为92％，漏诊率为36％，误诊率为8％，阳性似然比为8.0。免疫组化结果显示RFA后中央坏死区无表达，残存肿瘤内MVD、VEGF早期低水平表达，2周左右略升高，但仍较术前减低。残癌VEGF阳性率平均值为83％，MVD平均值为86.78±3.76。MVD及VEGF与BF、BV、ALP、HPI具有相关性，但是与PMB、PVP无相关性(P＞0.05)。　　 双能碘含量分析表现:碘含量体模研究中，双能碘含量测量值与真实值具有较强相关性(r=0.999，P＜0.0001)，Bland-Altman分析显示数据差值的均数的平均值为0.11 mg/ml，所有散点均位于一致性界限范围内。RFA术后2周组动脉期、术后3周动脉期、静脉期残癌的碘浓度值明显高于炎症反应的碘浓度值（1.72±0.27 mg I/ml vs.1.18±0.20，P＜0.01），(1.70±0.14 mg I/ml vs.0.95±0.19，P＜0.05)，（1.60±0.14 mg I/ml vs.1.22±0.15，P＜0.05)。类似结果，RFA术后2周组动脉期、术后3周动脉期、静脉期残癌的标准碘浓度值明显高于炎症反应的碘浓度值（13.1±2.0％vs.9.0±1.3％，P＜0.01），(12.1±1.1％ vs.6.7±1.2％，P＜0.05)，(40.3±4.5％vs.30.4±1.2％，P＜0.05)。RFA术后3天组及1周组残癌及炎症反应的碘浓度值及标准碘浓度值无统计学差异(P＞0.05).平衡期残癌、炎症反应与肝实质肉眼区分不明显，数据未纳入分析。利用ROC曲线法对RFA后2周组动脉期的碘浓度值及标准碘浓度值分析显示:碘浓度值的曲线下面积0.861，当界值为1.40 mg/ml时残癌诊断的灵敏度为83.3％、特异度为83.3％;标准碘浓度值的曲线下面积0.861，当界值为0.105时，残癌诊断的灵敏度为83.3％、特异度为83.3％。　　 残癌与炎症反应的能谱曲线均呈缓慢下降趋势，但表现不同。在40Kev-70Kev范围内CT值衰减曲线下降趋势较显著，二者的曲线斜率在RFA术后3天的动静脉期及1周组的动脉期无统计学差异，在1周组的静脉期、2周组及3周组有统计学差异。利用ROC曲线法对RFA后曲线斜率分析显示:1周组静脉期的曲线斜率的曲线下面积0.806，当界值为1.532时残癌诊断的灵敏度为66.7％、特异度为66.7％;2周组动脉期的曲线斜率的的曲线下面积0.806，当界值为1.548时，残癌诊断的灵敏度为83.3％、特异度为66.7％;2周组静脉期的曲线斜率的的曲线下面积0.833，当界值为1.362时，残癌诊断的灵敏度为83.3％、特异度为66.7％。对碘含量分析和能谱曲线斜率进行序列实验后，灵敏度为70％、特异度为95％，漏诊率为30％，误诊率为5％，阳性似然比为14.0。　　 3.射频消融热凝术后疗效评估的MRI功能影像学实验研究兔肝VX2瘤冷极射频治疗后病灶随着时间的改变而其DWI表现各有不同。1周内各b值时炎症反应带、残癌ADC值相比P值均＞0.05，无统计学差异。术后第2周及第3周时各(v)值(b=200、600、1000 s/mm2)不同组织ADC值比较P均＜0.05(Table1，2)。术后第2周时b=200 s/mm2时SNR、CNR、SIR分别为254.3±42.2、35.1±10.1、3.1±0.5，b=600 s/mm2时分别为198.0±44.0、20.2±8.2、2.7±0.8，b=1000 s/mm2时分别为151.7±24.2、9.6±3.4、3.3±1.0。随b值的增高，DWI图像中病灶的性能参数CNR、SNR降低，SIR值增高，兼顾图像质量和ADC值的准确性综合分析后，确立最佳扩散敏感系数为b=600 s/mm2。术后第2周b=600 s/mm2时，ROC曲线分析显示残癌ADC值的诊断阈值为1.71×10-3mm2/s时鉴别残癌与炎症反应，曲线下面积为0.667，其灵敏度为67％，特异度为83％。　　 DCE-MRI表现，时间信号强度曲线中，RFA术后中心消融坏死区的SI-T曲线呈平坦的水平线或类锯齿形。本组病例7d内残癌及炎症均呈Ⅱ型曲线，各参数值无明显差异(P＞0.05);第14d的残癌组、炎症组SI-T曲线分别为Ⅰ型者1、4例，Ⅱ型者2、3例，Ⅲ型者5、1例，以Ⅲ型SI-T曲线单项指标诊断残癌的灵敏度、特异度及准确度分别为62.5％、87.5％、75.0％。第14天时残癌组与炎症反应组Tmax、R(P＜0.05)均有统计学差异，ROC曲线分析显示当R值取界值2.185时，曲线下面积为0.917，残癌诊断的灵敏度83.3％，特异度83.3％(Fig.14)。第21天时间段残癌组与炎症反应组Tmax、SIm％、R(P＜0.05)均有统计学差异。免疫组化指标显示MVD及VEGF与R具有相关性，但是与Tmax无相关性。　　 肝脏MRS图像成功率较低为55％，1H-MRS波谱图结果显示，最多可见到5个主要的代谢物波峰，位置取值范围为0～4.35 ppm。RFA治疗后残癌Cho峰的峰高较治疗前增高，3d，7d组残癌和炎症反应的Cho/Cr比值无统计学差异(P＞0.05），14d，21d组残癌和炎症反应的Cho/Cr比值有统计学差异(P＜0.05）。RFA治疗后14d ROC曲线分析后表明，Cho/Cr比值取界值为0.858时，曲线下面积为0.778，残癌诊断的灵敏度、特异度分别为66.7％、66.7％。各时间点Lip/Cr比值在二者中均无统计学差异。　　 4.多种功能影像技术对残癌诊断效能的综合研究联合试验后，诊断效能高于单纯一种影像手段，DCE-MRI和能谱成像、DCE-MRI和CTPI联合后效果较好。随着灵敏度减低、特异度及漏诊率升高，阳性似然比增大，诊断价值随之增大。　　 结论:　　 1.CT引导下经皮瘤组织块种植法制作VX2肝癌模型，操作简单微创、成功率高、是一种理想的建立肝肿瘤模型的方法，尤其适用于肝癌治疗的相关影像学研究。　　 2.兔肝VX2肿瘤射频消融后残癌模型成功模拟人类原发肝癌射频的不完全消融，制作方法简易可行，可重复性较强，为原发性肝癌RFA后的相关影像学研究、残癌进行定量及定性等方面的研究的较理想动物模型。　　 3.RFA术后1周消融灶周围急性炎症显著，术后14d炎性反应减弱，少许纤维组织增生，术后21d炎症反应少量存在，大量纤维肉芽组织增生。炎症反应的时间变化趋势是残癌及炎症反应影像鉴别的病理学基础。　　 4.双能CT灌注成像参数可以动态的反映残癌的生物学行为，射频消融治疗后残癌在早期受到抑制，但2周后有上调趋势，提示肿瘤一次消融不完全时需要积极下一步治疗。BF、PMB在RFA后早期有助于残癌及炎症反应的鉴别诊断。双能CT碘含量定量分析和能谱曲线的形态及曲线斜率有助于RFA后残癌的鉴别诊断，二者联合应用，诊断残癌的特异度明显提高，应用前景广阔。　　 5.DCE-MRI成像参数R可以动态的反映残癌的血供改变，在RFA后早期有助于残癌及炎症反应的鉴别诊断。尤其是SI-T曲线类型、R诊断价值更大。MRS扫描成功率较低，作为补充影像手段。DWI(b=600 s/mm2)可以在RFA后2周为鉴别残余瘤和炎症反应带提供帮助。　　 6.肝癌RFA后早期影像评估诊断策略:在经济情况及身体情况允许下行DCE-MRI扫描，结合能谱成像或双源CT灌注作为优选方案，弥散成像及波谱成像可做补充;若经济情况不允许时首选双源能谱成像扫描，次之行双源CT灌注扫描，诊断困难时加做弥散成像及波谱成像。