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目的1.理论梳理:诠释刘雁峰教授对于卵巢子宫内膜异位囊肿独特的病机认识和治疗观点。2.观察中药温肾暖肝消癥方对卵巢子宫内膜异位囊肿患者的中医证候、痛经、血清CA125和卵巢异位囊肿大小的影响,探讨温肾暖肝消癥方对卵巢子宫内膜异位囊肿的临床疗效性。3.通过比较卵巢子宫内膜异位囊肿患者异位囊壁组织、在位内膜和其他卵巢良性肿瘤患者子宫内膜(对照内膜)的组织学特点及分子生物学特征,探究TGF-β1、Smads在子宫内膜异位症中的致纤维化作用,初步揭示子宫内膜异位症纤维化形成的可能机制。4.研究TGF-β1/Smads通路在子宫内膜异位症异位病灶纤维化中的作用机制,探讨中药温肾暖肝消癥方对子宫内膜异位症模型小鼠的治疗作用及其对异位病灶纤维化的影响,寻找温肾暖肝消癥方对子宫内膜异位囊肿纤维化治疗的作用靶点及生物学机制。方法1.从“肾阳虚,肝脉寒伏、瘀结成癥”辨析卵巢子宫内膜异位囊肿的病机特点,并对温肾暖肝消癥法进行阐述,解析温肾暖肝消癥方的药对特点和功效。2.以自身前后对照研究方法,收集阳虚寒凝血瘀型卵巢子宫内膜异位囊肿患者35例,给予中药温肾暖肝消癥方治疗,观察患者治疗前后中医证候评分、VAS评分、痛经症状评分、血清CA125水平、卵巢异位囊肿大小的差异,分析温肾暖肝消癥方对卵巢子宫内膜异位囊肿患者的临床疗效。3.收集行腹腔镜手术的卵巢子宫内膜异位囊肿患者20例,取其卵巢异位囊壁组织作为异位囊壁组,其中9例行宫腹联合术者并留取其内膜组织作为在位内膜组;同期行宫腹联合术的其它卵巢良性肿瘤患者9例,取其内膜组织作为对照内膜组。采用免疫组织化学法检测三种组织中TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7的表达,分析各组表达含量的差异性。4.(1)采用腹腔注射法建立子宫内膜异位症模型小鼠,采用HE、Masson染色分析异位病灶组织形态和纤维化情况。(2)将动物分为空白组、假手术组、疾病模型组、中药高剂量组、中药中剂量组、中药低剂量组、西药组,应用Masson染色对比各组小鼠异位病灶纤维化情况,应用Elisa检测法对比各组小鼠血清TGF-β1水平,应用免疫组织化学法、q PCR、Western blot方法检测空白组和假手术组小鼠子宫、其余各组小鼠异位病灶TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7、ColⅠm RNA和蛋白表达,分析各组表达含量的差异性。结果1.温肾暖肝消癥方对卵巢子宫内膜异位囊肿临床疗效:(1)中医证候:温肾暖肝消癥方可明显改善卵巢子宫内膜异位囊肿患者阳虚寒凝血瘀证候(P<0.01)。(2)痛经:温肾暖肝消癥方可明显缓解患者的痛经程度(P<0.01)和相关症状(P<0.01)。(3)血清CA125水平:温肾暖肝消癥方可降低患者血清CA125水平(P<0.01)。(4)异位囊肿大小:温肾暖肝消癥方治疗后,患者异位囊肿较治疗前减小,但治疗前后差异无统计学意义(P>0.05)。2.人卵巢子宫内膜异位囊肿纤维化机制:(1)纤维化染色:Masson染色后蓝染区域为纤维化,异位囊壁组织可见大量的纤维化沉积,在位内膜组、对照内膜组中增殖期和分泌期内膜,均未见到明显纤维化蓝染。(2)TGF-β1表达:异位囊壁组TGF-β1表达水平最高,但与在位内膜组之间无统计学差异(P>0.05),与对照内模组之间表达有统计学差异性(P<0.01);在位内膜组TGF-β1表达水平高于对照内膜组,但差异无统计学意义(P>0.05)。(3)p-Smad2/3表达结果:异位囊壁组p-Smad2/3表达最高,但与在位内膜组之间无统计学差异(P>0.05);对照内膜组p-Smad2/3表达最低,与异位囊壁和在位内膜组之间均有统计学差异(P<0.05)。(4)Smad7表达结果:异位囊壁组Smad7的表达含量最低,与在位内膜组和对照内膜组差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01);在位内膜组Smad7的表达含量较对照内膜组低,差异有统计学意义(P<0.01)。3.温肾暖肝消癥方对子宫内膜异位症模型小鼠异位病灶纤维化影响的实验研究:(1)模型建立情况:模型在建模后21天相对稳定,异位病灶可见大量纤维染色,主要分布在间质和肌层,异位病灶存在大量的胶原纤维生成和沉积。(2)异位病灶大小:中药高、中、低剂量组和西药组异位病灶较疾病模型组减小,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01),各干预组之间无统计学差异(P>0.05)。(3)纤维化程度:空白组与假手术组小鼠子宫纤维化面积比率无统计学差异(P>0.05),疾病模型组异位病灶纤维化面积比率与空白组小鼠子宫相比增加(P<0.01),与疾病模型组异位病灶相比,中药高、中剂量组异位病灶纤维化面积比率降低(P<0.05),中药低剂量组和西药组纤维化面积比率降低,但差异无统计学意义(P>0.05)。(4)血清TGF-β1水平:假手术组与空白组小鼠相比血清TGF-β1水平无统计学差异(P>0.05),疾病模型组比空白组小鼠血清TGF-β1表达明显升高(P<0.01);与疾病模型组相比,中药高、中、低剂量组和西药组小鼠血清TGF-β1水平明显降低(P<0.05,P<0.01);中药各剂量组之间,高剂量组血清TGF-β1水平最低,中药高剂量组与西药组之间无统计学意义(P>0.05)。(5)TGF-β1/Smads通路:(1)基因表达:假手术组与空白组小鼠子宫TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7、ColⅠm RNA水平无统计学差异(P>0.05),疾病模型组比空白组小鼠TGF-β1、Smad2、Smad3、ColⅠm RNA表达明显升高(P<0.01),Smad7表达明显降低(P<0.01);与疾病模型组相比,中药高剂量组、西药组TGF-β1、ColⅠm RNA水平明显降低(P<0.01),中药高剂量组、中药中剂量组、西药组小鼠异位病灶Smad2、Smad3m RNA水平明显降低(P<0.05,P<0.01),中药高剂量组、西药组小鼠异位病灶Smad7水平明显升高(P<0.01)。(2)蛋白表达:假手术组与空白组小鼠子宫TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7、ColⅠ蛋白水平无统计学差异(P>0.05),疾病模型组比空白组小鼠TGF-β1、Smad2、Smad3、ColⅠ蛋白表达明显升高(P<0.01),Smad7表达明显降低(P<0.01);与疾病模型组相比,中药高剂量组、西药组小鼠异位病灶TGF-β1、p-Smad2/3水平明显减低(P<0.01),中药高剂量组、中药中剂量组、西药组小鼠异位病灶ColⅠ水平降低(P<0.05,P<0.01),中药高剂量组、西药组小鼠异位病灶Smad7水平升高(P<0.05,P<0.01)。结论1.临床疗效性观察研究结果显示,温肾暖肝消癥方可以有效改善卵巢子宫内膜异位囊肿患者阳虚寒凝血瘀证候、减轻痛经程度、降低血清CA125水平,缩减异位囊肿的大小,防止其进展,临床疗效肯定。2.人卵巢子宫内膜异位囊肿纤维化机制研究结果显示,TGF-β1、p-Smad2/3在子宫内膜异位症中存在高表达,其可能通过促进纤维母细胞增生、胶原蛋白的沉积从而导致内异症纤维化的形成,而Smad7作为抑制因子,在子宫内膜异位症中表达降低,则对Smad介导得TGF-β1致纤维化的抑制作用减弱,也促使了子宫内膜异位症纤维化的进展。3.实验研究结果显示,温肾暖肝消癥方可减缓子宫内膜异位症模型小鼠异位病灶的生长,抑制异位病灶纤维化形成,这可能与其干预TGF-β1/Smads通路,从而影响异位病灶纤维化形成和进展,来发挥“消癥”作用。