刺激隐核虫是一种能寄生于几乎所有海水硬骨鱼的遍身性纤毛虫,常寄生于鱼体表及鳃内,严重感染时常造成爆发性流行病,给海水经济鱼类养殖带来了巨大的危害,目前尚无安全有效的防治方法。有研究表明,寄生虫的半胱氨酸蛋白酶在其整个生活史都发挥着重要的作用,可能作为防治寄生虫病的靶点之一。在前期工作中,本人所在研究室从刺激隐核虫的c DNA文库中筛选了刺激隐核虫的木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶基因（简称类木瓜蛋白酶,CiPCP）,发现原核表达的重组蛋白对大黄鱼具有一定的免疫保护效果。本项目则检测了该基因是否能在大黄鱼细胞和酵母细胞中真核表达并初步评估了真核表达的载体对大黄鱼的免疫保护作用。具体研究成果如下:1.原代分离培养了大黄鱼鳃上皮（PCG）和脑髓组织（PCB）细胞,分别经过37次和40次的继代后,两种细胞均生长良好;进行了染色体核型分析,发现培养的两种细胞的染色体数均为48,与大黄鱼的相符,说明大黄鱼的PCG和PCB两种细胞系成功建立;比较了两种细胞在不同培养基的生长情况,发现以DME/F-12添加10%胎牛血清为佳。2.构建了全长和截短的刺激隐核虫类木瓜蛋白酶基因（CiPCP和CiPCPt）的真核表达质粒pcDNA/CiPCP和pcDNA/CiPCPt,并将pcDNA/CiPCPt质粒转染大黄鱼PCG和PCB细胞,以pcDNA为阴性对照,间接荧光抗体实验结果说明刺激隐核虫基因可以在大黄鱼的细胞中表达。3.用质粒pcDNA/CiPCP和pcDNA/CiPCPt肌肉注射大黄鱼鱼苗,免疫2周后,用亚致死剂量感染性刺激隐核虫幼虫（3000虫/鱼）对免疫过的大黄鱼进行攻毒,观察大黄鱼的存活率。结果显示,与未免疫组的大黄鱼比较,pcDNA/CiPCP和pcDNA/CiPCPt免疫组分别获得了44.5%和37.9%的免疫保护率。实时定量PCR结果显示pcDNA/CiPCP和pcDNA/CiPCPt免疫组大黄鱼的肝、脾、肾脏中的Interleukin-1β基因的表达均有上调,肝脏中IL-8A、Myd88和TLR-8基因的表达也有上调,肾脏中Myd88基因的表达也略有上调,综合表明所构建的pcDNA/CiPCP和pcDNA/CiPCPt对大黄鱼的刺激隐核虫感染有一定的免疫保护作用。4.以pPICZ A为载体构建了刺激隐核虫CiPCPt的毕赤酵母表达系统,并成功电转入酵母GS115菌株,诱导表达出重组蛋白r CiPCPt。但高表达的酵母菌株的筛选有待于今后继续进行,以便进一步研究该酶的性质及评估其对宿主的免疫保护作用。综上所述,本项目建立了两个大黄鱼的细胞系,不仅证明了以pcDNA为载体的外源基因可以在大黄鱼细胞中表达,还为今后探讨刺激隐核虫的体外培养、宿主与病原之间的相互关系奠定了基础;刺激隐核虫CiPCP的重组质粒DNA对大黄鱼的免疫保护效果的评估,为大黄鱼的刺激隐核虫病的免疫预防提供了参考资料。