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目的血管性痴呆(vascular dementia,VD)是由一系列脑血管因素引起的痴呆综合征。对脑组织造成不同程度的损害,主要的临床表现是记忆力衰退,表情冷漠,呆滞和性格改变。它至少占痴呆总数的20%以上,伴随着人口老龄化的加剧,血管性痴呆患者不断增多,已成为影响老年人生存率的危险性疾病。研究发现,短暂性的缺血缺氧损伤以及缺血再灌注损伤对人和动物的脑海马神经元损伤最大,海马区域与学习和记忆能力关系紧密,神经元迟发性死亡被认为是发生血管性痴呆的机制之一。因此近年来血管性痴呆的治疗研究主要是防止或减少缺血后神经细胞的凋亡的发生。磷酸肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(Phosphoinositide-3-kinase/protein kinase B,PI3K/Akt)信号通路是细胞内重要的信号转导途径,通过多种细胞因子介导在细胞存活中起重要作用。β-catenin为Wnt信号通路中不可缺少的信号分子。它不仅可以通过与E-钙粘蛋白细胞粘附形成复合物,参与细胞间的粘附,还可以进入细胞核,激活转录因子,并促进细胞存活和增殖。目前,关于PI3K/Akt信号通路对Wnt/β-catenin信号通路的调控作用的研究主要集中在抗肿瘤方面,尚未见到该调控是否在缺血性脑损伤中起作用。为了建立大鼠血管性痴呆模型,我们使用了两血管阻断加硝普钠降压法。研究检测PI3K和β-catenin在血管性痴呆皮质和海马组织中的表达及IGF-1和LY294002的干预作用,探讨血管性痴呆大鼠内源性PI3K/Akt信号通路和Wnt/β-catenin信号通路分子的改变对缺血神经元协同修复的机制。方法1、健康雄性SD大鼠48只,10～12周龄,体质量250～300g。均购自辽宁长生生物技术股份有限公司,实验动物质量合格证号(SCXK(辽)2015-0001)。采用两血管阻断加硝普钠降压法制作大鼠血管性痴呆模型,首先采取随机法,将SD大鼠分为假手术组(S组)、脑缺血再灌注组(I/R组)、脑缺血再灌注+抑制剂LY294002后处理组(LY组)、脑缺血再灌注+IGF-1后处理组(IGF-1组),每组大鼠12只。采用两血管阻断加硝普钠降压法制作大鼠血管性痴呆模型。S组仅分离动脉,不阻断血流,余同手术组。LY组于缺血再灌注前15min按照0.3 mg/kg经尾静脉注入LY294002到大鼠体内。IGF-1组,IGF-1按照14μg/kg在大鼠缺血再灌注后1小时经尾静脉注入,S组和I/R注射1ml生理盐水。2、神经行为学评分在各组大鼠麻醉清醒后进行模型筛选,评分参照Zea Longa5分制标准,同时检测IGF-1和LY294002对VD大鼠行为学修复的干预作用。3、穿梭箱测试各组大鼠的认知功能,探讨脑缺血、IGF-1和LY294002对VD大鼠认知功能的影响。4、HE染色检测皮质及海马组织学改变情况,及IGF-1和LY294002的干预情况。5、采用免疫组织化学法检测在各组皮质和海马缺血再灌注后PI3K和β-catenin的表达变化及IGF-1和LY294002对这两种蛋白表达的干预作用。6、采用Western blot检测在各组皮质和海马缺血再灌注后PI3K和β-catenin的表达变化及IGF-1和LY294002的干预情况。结果1、行为学评分结果:S组大鼠神经功能评分为零。与I/R组和LY组相比,IGF-1组的实验大鼠神经功能评分明显降低。2、穿梭箱测试结果:应用穿梭箱实验检测各组大鼠认知功能的变化、及通过主动回避反应率(Active avoidance reaction,AAR)和被动回避反应率(Passive avoidance reaction,PAR)讨论脑缺血再灌注损伤对VD大鼠认知功能的影响。与S组相比,I/R组和LY组的回避反应率均下降,LY组的回避反应率下降更明显,组间比较差异显著。IGF-1组的回避反应率有所上升,高于I组和LY组,I/R、LY和IGF-1组血管性痴呆模型建立成功。3、HE染色结果:我们观察大鼠皮质和海马的组织切片,在光镜下评估由脑缺血再灌注导致的脑组织学改变。S组神经元数量多,排列整齐,形态完整。在I/R组和LY组中,观察到神经元数量减少,分布不均,细胞周围的间隙变宽,胞体肿胀明显,视野下部分细胞体积缩小,细胞核呈典型的固缩深染,特别是LY组大鼠脑组织损伤更重,组织学变化更明显。与I/R组和LY组相比,IGF-1组切片上观察到,皮质和海马中存活的神经元数量增加,神经元细胞肿胀程度减轻。4、免疫组化染色检测结果:为了调查IGF-1和缺血再灌注是否激活PI3K/Akt和Wnt/β-catenin信号通路,在各组大鼠脑缺血再灌注后检测PI3K和β-catenin的表达。S组在大鼠皮质和海马少量表达PI3K和β-catenin阳性产物。I/R组皮质和海马PI3K和β-catenin阳性产物发现灌注后表达增多,较S组表达增多。LY组PI3K和β-catenin的表达较I/R组PI3K和β-catenin的表达量明显减少。而IGF-1组PI3K和β-catenin的表达量明显较I/R组和LY组增加。5、Western blot检测结果:通过Western blot方法检测各组大鼠缺血再灌注后PI3K和β-catenin蛋白表达,评估IGF-1和LY294002对PI3K/Akt和Wnt/β-catenin信号通路表达影响。I/R组和LY组皮质和海马PI3K和β-catenin阳性产物表达较S组增多。而IGF-1组的表达比I/R组和LY组进一步增加。结论1、IGF-1促进血管性痴呆大鼠认知功能和行为学的损伤修复,这种保护作用会被特异性PI3K/Akt信号通路阻断剂LY294002所抑制,提示IGF-1可以通过激活PI3K/Akt信号通路来促进血管性痴呆大鼠的认知功能的损伤修复。2、IGF-1促进缺血皮质和海马神经元的存活,这种保护作用会被特异性PI3K/Akt信号通路阻断剂LY294002所抑制,提示IGF-1通过激活PI3K/Akt信号通路起作用。3、IGF-1可以激活缺血性脑损伤中的PI3K/β-catenin信号通路,而LY294002作为PI3K/Akt信号通路抑制剂可以有效抑制IGF-1的这种作用。