m~6A是一种在mRNA和非编码RNAs中广泛存在的,动态且可逆的甲基化修饰。在神经发育以及神经环路形成等过程中m~6A修饰发挥着调控作用。但是,现进行的研究主要是对m~6A的甲基化修饰酶“writers(刻写器)”和去甲基化修饰酶“erasers(擦除器)”的研究,而对m~6A修饰的识别和结合蛋白“readers(阅读器)”的研究很少,具体在m~6A修饰调控小脑发育的研究中,其readers的功能和机制目前还未见报道。本课题利用神经系统特异性表达的Nestin-cre敲除m~6A的writer METTL14,发现METTL14敲除后的小鼠体型明显变小,小脑萎缩。鉴于敲除writer后导致严重的小脑发育缺陷,说明m~6A修饰对于小脑发育至关重要。我们分别在小脑的两类主要神经元即浦肯野细胞和颗粒细胞中分别研究m~6A修饰,本课题主要集中研究m~6A修饰对浦肯野细胞发育和功能的调控作用和机制。本课题利用Rosa26m T/m G报告基因鼠确定了小脑浦肯野细胞特异表达的L7-cre和Pcp2-cre在小脑中的表达谱,我们发现L7-cre的表达要早于Pcp2-cre。因为后者表达过晚,对于浦肯野细胞发育研究的用途比较有限,我们在本课题研究中主要使用了L7-cre小鼠。我们将Cre鼠分别与Mettl14fl/fl,Ythdf1fl/fl和Ythdf2fl/fl交配收集c KO和同窝对照ctrl小鼠,经过灌流固定,脱水包埋,冷冻切片和免疫荧光观察敲除后对小鼠小脑浦肯野细胞发育的影响,包括浦肯野细胞产生,树突发育等参数,同时也进行小脑功能相关的一些行为学测验,包括Rota rod、Grip Strength、Open field和Footprint这四种方法,观察敲除后对小鼠小脑控制的运动功能的影响。我们初步发现浦肯野细胞中特异性敲除METTL14、YTHDF1或YTHDF2后,小脑浦肯野细胞的产生和早期发育没有受到明显的影响,对整个小脑的早期发育也没有产生明显的影响。但是在Rota rod行为学测验中,浦肯野细胞特异性敲除的Ythdf2 c KO小鼠的运动协调能力表现出了明显的增强,而Ythdf1 c KO小鼠的行为学测验没有明显差异。因此我们初步可以得出浦肯野细胞中的阅读器蛋白YTHDF2可能是调控小脑功能的一个重要reader。通过后续进一步的机制研究,我们将阐释m~6A修饰通过其阅读器蛋白调控小脑神经环路和功能的作用和机制。