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目的利用免疫系统来识别和控制肿瘤生长的概念可以追溯到1893年,William Coley曾使用活细菌作为免疫刺激剂来治疗癌症[1]。近年来,在研究癌症如何逃避免疫系统的监视方面取得了巨大进展,研究发现多种免疫细胞在此过程中起到了重要的作用,这反过来又为阻止癌症免疫逃逸提供了新的思路[2]。骨髓来源的抑制性细胞(MDSC)是炎症和癌症过程中调节免疫反应的重要部分。MDSC是一群来自于骨髓干/祖细胞的异质性细胞群,主要包括未成熟的粒细胞、树突状细胞、巨噬细胞和早期未分化的髓样前体细胞[3]。在肿瘤、慢性炎症的情况下,机体会产生.GM-CSF、G-CSF、VEGF和IL6等多种细胞因子,在髓腔中,此类细胞因子会诱导骨髓祖细胞的异常分化,导致MDSCs的形成[4]。在人类体内,MDSCs被定义为共表达CD11b和CD33但缺乏HLA-DR的一群细胞,主要包括CD15+的PMN-MDSC(多形核MDSCs)和CD14+的M-MDSC(单核MDSCs)。在小鼠体内,MDSCs被定义为CD11b+Gr1+的一群细胞,主要包括 CD1 1b+Ly6G+Ly6Clo的 PMN-MDSCs 和 CD1 1b+Ly6G-Ly6Chi 的 M-MDSCs[5]。MDSC通过表达ARG-1、NOS2、IL-10等免疫抑制性基因以及产生NO、ROS来形成免疫抑制性的肿瘤微环境,并可通过OLR1等基因改变自身的脂代谢,从而抑制T细胞的免疫反应并介导免疫抑制[6]。N6-甲基腺苷(m6A)甲基化修饰是真核细胞中最丰富的表观遗传学修饰方式,在哺乳动物正常发育和疾病发生发展过程中都起到重要的作用,在包括真核信使RNA(mRNA)、微小RNA(miRNA)、和长链非编码RNA(lncRNA)的转录后修饰过程中都有重要功能,被认为是RNA分子上最普遍,可逆和丰富的内部修饰之一[7]。在哺乳动物中,由酶亚基METTL3、底物识别亚基METTL14和调节亚基WTAP组成的甲基转移酶复合物催化目的RNA在RRACH(其中R=G或A,H=A,C或U)的共有序列内向腺嘌呤的N6位点添加甲基,即称为m6A。同时,已经发生m6A甲基化修饰的RNA可以被甲基酶FTO和ALKBH5清除m6A甲基修饰[8,9]。在分子水平上,m6A修饰水平发生改变的RNA可以被甲基阅读蛋白阅读其上的修饰信息,从而通过不同方式改变RNA的代谢。m6A修饰影响RNA代谢的几乎每个步骤,包括mRNA的加工、核输出、翻译、降解以及长链非编码RNA(lncRNA)和微小RNA(miRNA)的形成和降解,在生物发育的各个过程中都发挥作用[10]。最近,越来越多的研究发现细胞m6A修饰水平的改变与癌症的发生发展息息相关,m6A修饰能够参与肿瘤干细胞的自我更新,促进癌细胞的增殖以及对放射疗法或化学疗法的抗性[11]。目前已经在多种癌种中发现了 m6A修饰的相关目的基因,并明确了参与该过程的下游相关通路,这表明m6A甲基化水平、相关酶及其修饰位点可能是癌症治疗的新靶标;也有一些研究表明,细胞整体m6A甲基化水平的变动与癌症的发展有关,并可能与多种免疫细胞的变化有关[8]。细胞m6A甲基化水平的改变可以作为鉴定癌症不同分期和免疫细胞不同亚型之间互相转换的指标。既往的研究表明多种细胞因子、转录因子、信号通路、以及表观遗传学修饰等机制都参与了 MDSC的形成、分化和免疫抑制功能的发挥[12],且m6A甲基化修饰在骨髓细胞的增殖分化过程中起着重要的调控作用[13],但是m6A RNA甲基化修饰及相关甲基化酶类对MDSC的影响尚无具体研究报道。因此,本课题旨在探究骨髓细胞m6A甲基化水平的改变对MDSC形成、分化和免疫抑制功能所起的调控作用,以及与MDSC m6A甲基化水平的改变相关的甲基化酶类,以期探讨MDSC形成和发展的新机制,为癌症的免疫治疗提供新的研究思路。方法从C57BL/6小鼠的股骨中获得骨髓细胞(BMC),并在添加GM-CSF及G-CSF的1640培养基中培养以进行MDSC的体外诱导,72h后采用流式细胞术检测CD11b+Gr-1+细胞的比例,与原始BMC进行对比,利用RT-PCR检测MDSC免疫抑制功能相关基因的表达,并在CD11b+的细胞中分别检测Ly6G+Ly6Clo和Ly6G-Ly6Chi的细胞比例。之后利用m6A甲基化水平检测试剂盒检测诱导细胞的整体m6A水平,与BMC进行对比。接下来,在诱导MDSC的同时添加细胞甲基化水平抑制剂DAA以降低m6A甲基化水平,利用流式细胞术检测MDSC的诱导比例并检测两亚群的比例变化,用RT-PCR技术检测免疫抑制基因的表达变化。研磨小鼠脾脏并用免疫磁珠细胞分选法获取CD8+T细胞,利用CD3/CD28活化微珠激活CD8+T细胞,24小时后将其与不同方式诱导的MDSC共孵育,72h后检测T细胞表面Ki67的表达量,并用CFSE实验检测T细胞增殖能力的变化。利用RT-PCR检测MDSC中m6A相关甲基酶的变化,并与数据库进行对比,发现甲基转移酶METTL3的表达量显著降低,可能与MDSC m6A甲基水平下降以及免疫抑制功能增强相关。通过与TCGA数据库进行对比发现METTL3低表达的LUAD患者预后较差,磁珠分选LUAD患者外周血的MDSC,并与正常人外周血的髓系细胞进行对比,RT-PCR验证LUAD患者外周血MDSC中METTL3表达量的改变。结果1.流式结果显示,利用GM-CSF+G-CSF诱导MDSC的方式显著提高了 CD11b+Gr-1+细胞的比例,且此群细胞中Ly6G+Ly6Clo细胞比例较高。2.RT-PCR 验证利用 GM-CSF+G-CSF 诱导的细胞 ARG-1、NOS2、TGF-β基因的表达量显著增高。3.m6A甲基化定量检测实验表明MDSC的m6A甲基化修饰水平显著降低。4.m6A甲基化定量检测实验表明应用DAA使得MDSC的m6A甲基修饰水平显著降低。5.流式结果显示,DAA不改变诱导MDSC的整体比例,但改变其亚群的比例,使其Ly6G+Ly6Clo细胞比例降低,Ly6G-Ly6Chi细胞比例升高。6.RT-PCR 验证利用 DAA 使得 MDSC 中 ARG-1、IL-10、OLR1、TGF-β基因的表达量显著升高。7.Ki67流式结果和CFSE实验结果表明,应用DAA使得MDSC抑制CD8+T细胞增殖的能力增强。8.RT-PCR和Western blot实验结果验证MDSC中METTL3的基因和蛋白表达量显著降低,且在加入DAA后METTL3进一步降低。9.TCGA数据库验证LUAD患者肿瘤组织中METTL3表达降低,且与OS降低相关,RT-PCR结果显示LUAD患者外周血MDSC中METTL3表达量显著降低。结论MDSC相较正常BMC具有更低的m6A甲基化修饰水平,且m6A甲基化水平降低改变了 MDSC的分化方向,与其免疫抑制功能增强有关。MDSC中m6A甲基化修饰水平降低与其METTL3表达量下降有关,LUAD患者肿瘤组织和外周血MDSC中METTL3低表,与其预后较差相关。