非酒精性脂肪肝病（non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD）是全世界最常见的慢性肝病，近年来随着人们生活水平的不断提高和生活方式改变，我国 NAFLD 患者急速攀升，据统计，成人约有30%患有NAFLD且呈更加年轻化趋势发展。NAFLD的发病机制目前有“二次打击学说”和“多重打击学说”，其中占据主导地位的是“二次打击学说”。NAFLD 严重影响健康，不仅影响肝胆等消化系统功能，还与肥胖、高血脂、糖尿病、心脑血管疾病等密切相关，已成为多学科共同关注的医学和社会问题。NAFLD在世界范围内的流行和年轻化趋势是一项巨大的公共卫生挑战，但迄今为止，还没有批准用于 NAFLD 治疗的专门药物。在过去的几十年里，维生素 E、降脂药物、胰岛素增敏剂等药物不断用于 NAFLD 的治疗，但是这些药物的毒副作用和长期使用的安全性越来越受到广泛的质疑。因此，迫切需要新的预防和治疗策略来管理NAFLD。　　藤茶又名霉茶，广泛生长于我国湖北、湖南、贵州、广西等地区，在我国民间有上千年的“藤茶文化”饮用历史，是一种新资源食品。藤茶中富含黄酮类成分二氢杨梅素（dihydromyricetin, DHM），占藤茶叶、茎干重的30%以上。既往关于二氢杨梅素的作用研究主要集中在抗氧化、抗炎、降糖降脂、保肝、抗肿瘤等方面，本实验室前期初步研究发现，二氢杨梅素可有效改善非酒精性脂肪肝的糖脂代谢水平和胰岛素抵抗状态。然而，其中的确切分子机制尚未完全阐明，需进一步明确。　　近年研究发现，生物钟（Circadian clock）在维持代谢稳态中具有重要作用。生物钟系统是机体为适应地球自转产生了昼夜明暗交替循环，控制着行为和生理进程同步化于光线的周期变化，呈现出以约24 h为变动周期的昼夜节律。哺乳动物体内，生物钟包括位于下丘脑视交叉上核的“母钟”和位于肝脏、心脏及肾脏等外周组织的“子钟”，二者共享一套生物钟分子机制；其主要通过核心负反馈通路 Clock、Bmal1、Per(s)等基因产生反馈回路形成分子振荡，调控下游蛋白质节律性表达，对觉醒、摄食、代谢等生理行为产生重大影响。大量研究表明，机体代谢与存在于细胞、组织、器官和整体水平的昼夜节律相关。机体摄食/禁食循环依赖于许多代谢相关酶及激素基因的节律性表达，受机体生物钟控制，生物钟参与了包括三羧酸循环、糖酵解、氨基酸调控和脂类代谢等所有物质与能量代谢。研究发现，肝脏中38%的线粒体蛋白表达呈现明显的节律性振荡，除了与线粒体代谢直接相关酶，与线粒体动力学相关的线粒体融合蛋白（Mfn2、Opa1）、分裂相关蛋白（Fis1、Drpl）等表达也具有明显的节律性。总之，生物钟是生物在长期进化中形成的一种联系外界环境与机体活动、代谢的相对稳定的生理机制，通过预先设定的摄食/禁食周期来调控代谢底物选择及流量控制、线粒体功能和结构，以适应预期出现的摄食/禁食。因此，代谢与生物钟同步是维持机体正常代谢的基础，而去同步化将导致代谢紊乱进而诱导代谢性疾病发生。　　众所周知，线粒体是细胞的“动力工厂”，是脂质代谢的主要场所，同时也是ROS产生的重要来源。线粒体融裂形态的变化即线粒体动力学影响着其功能的改变，线粒体分裂相关基因Fis和Drp1分别位于线粒体的外膜和胞浆中，当其表达表达增强时，可加速线粒体的分裂，并可诱导细胞凋亡等过程；而线粒体融合相关蛋白Mfn2和Opa1则分别位于线粒体的外膜和内膜上，主要参与线粒体内外膜和嵴的调控；抑制融合蛋白的表达会导致线粒体的片段化。鉴于线粒体在脂代谢调节中的重要作用，因此线粒体的融合分裂功能与NAFLD发生发展关系密切，是防治NAFLD的潜在靶标。　　基于以上分析，我们推测肝脏的生物钟基因表达节律和线粒体融合与分裂功能的异常与NAFLD关系密切，二氢杨梅素干预可能通过恢复生物钟相关基因Clock、Bmal1、Per2的节律表达和改善线粒体融合与分裂相关基因Fis1、Drp1、Mfn2、Opal1的表达，进而对 NAFLD 发挥保护作用。本实验采用高脂饮食诱导的 NAFLD 动物模型，观察二氢杨梅素干预对脂质蓄积和脂质代谢的影响，并检测生物节律相关基因 Clock、Bmal1、Per2在昼夜6个授时时间的节律表达，以及线粒体融裂相关基因Fis1、Drp1、Mfn2、Opal1 的表达水平，旨在阐明二氢杨梅素对 NAFLD 的保护效应及其潜在作用机制，为其应用于NAFLD疾病的防治提供实验依据。　　主要研究结果和结论如下：　　(1)二氢杨梅素干预明显改善脂代谢，并显著抑制高脂喂养小鼠的肝脏脂质蓄积。高脂喂养组与对照组相比，体重与肝脏指数、血清血脂水平、肝脏脂质蓄积显著增加，而肝细胞耗氧率（oxygen consumption rate ,OCR）显著降低，表明高脂可导致肝细胞脂代谢能力降低进而诱导小鼠发生NAFLD。二氢杨梅素干预（100 mg/kg/d）干预12周后，上述指标显著改善，表明二氢杨梅素具有抗NAFLD的作用。　　(2)高脂诱导NAFLD发生伴有明显的生物节律紊乱，二氢杨梅素干预后显著改善了生物节律的紊乱。ZT6(02 pm)和ZT18(02 am)的NAFLD小鼠肝细胞OCR较正常对照组均显著降低，但两个授时时间的耗氧率无统计学差异，而生物钟相关基因Clock、Bmal1、Per2在ZT0、ZT4、ZT8、ZT12、ZT16、ZT20 等6个授时时间的表达节律丧失，表明高脂诱导 NAFLD 发生伴有明显的肝脏生物钟相关基因表达节律和肝脏代谢节律的紊乱。二氢杨梅素干预后，ZT6和ZT18肝细胞OCR显著升高，且ZT18显著高于ZT6；生物钟相关基因表达节律性显著恢复。表明二氢杨梅素显著改善了生物节律的紊乱。　　(3)高脂诱导 NAFLD 发生伴有明显的肝细胞线粒体融裂改变，二氢杨梅素干预后显著恢复了线粒体融裂的变化。NAFLD模型小鼠肝脏中线粒体分裂相关分子Fis1、Drp1表达水平较对照组显著增高，而线粒融合相关分子Mfn2、Opa1表达水平均显著降低，表明 NAFLD 发生伴有线粒体相关分裂蛋白的增高和融合蛋白的降低；二氢杨梅素干预 12 周后，线粒体融合分子 Mfn2、Opa1 表达显著增高，而分裂蛋白 Fis1、Drp1表达显著降低，提示二氢杨梅素显著恢复了线粒体融合分裂的变化。　　(4)二氢杨梅素可能通过生物钟相关基因调控线粒体融裂改善NAFLD。高脂组较对照组生物钟相关基因Clock、Bmal1、Per2节律丧失，线粒体分裂基因Fis1、Drp1表达增强，融合基因Mfn2、Opa1表达减弱；而二氢杨梅素干预后，生物钟相关基因Clock、Bmal1、Per2恢复节律性，线粒体融合基因Mfn2、Opa1表达增强，而分裂基因Fis1、Drp1表达减弱。结合文献报道及上述实验发现，我们推测高脂组较对照组生物钟相关基因节律丧失，导致线粒体分裂基因表达增强，融合基因表达减弱，最终导致 NAFLD 的发生；高脂加二氢杨梅素组可能通过生物钟相关基因节律的恢复调控线粒体的分裂基因表达减弱，融合基因表达增强，最终达到改善NAFLD的作用。　　综上所述，高脂喂养小鼠存在明显的肝脏脂质蓄积和脂质代谢紊乱，同时伴有肝脏生物钟相关基因（Clock、Bmal1、Per2）表达节律紊乱和线粒体融裂相关基因（Fis1、Drp1、Mfn2、Opal1）表达显著改变；二氢杨梅素干预能够显著改善 NAFLD 模型小鼠的脂质蓄积和脂质代谢，恢复生物钟相关基因的节律性，改善线粒体融裂相关基因的表达，并可能通过生物钟基因的节律表达调控线粒体融裂的变化，最终改善NAFLD。