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研究背景糖尿病视网膜病变(Diabetic retinopathy, DR)是糖尿病严重的并发症之一,目前对于糖尿病视网膜病变的发病机制并不完全明确,可能与多种因素共同参与有关,其中iNOS的高表达及其产生的高浓度NO是造成糖尿病视网膜病理改变的原因之一。Müller细胞是视网膜中重要的胶质细胞,在糖尿病视网膜病变的发生发展过程中,Müller细胞也起到了重要的作用。嘌呤受体亚型P2广泛存在于各种细胞上,执行多种重要的生理功能,P2Y2受体是嘌呤受体亚型P2Y受体的一种,在某些细胞病理过程中可能有P2Y2受体表达的变化,并参与到病变发展的过程中。目的1.分离纯化培养大鼠Müller细胞。2.建立体外Müller细胞高糖模型,观察高糖对P2Y2受体的影响。3.观察P2受体非特异性抑制剂苏拉明对高糖状态下Müller细胞iNOS表达的影响。方法1.Müller细胞的培养与鉴定:从出生1周内SD大鼠取眼球,分离并剪碎视网膜组织,胰蛋白酶消化,将消化后的悬浊液经53μm筛网过滤后,离心获得混合游离细胞,加入含20%FBS的培养基继续培养,每3 d换液。改良酶消化法纯化细胞2-3次,按1:2比例传代,取第3-4代细胞进行GFAP和GS鉴定。2.高浓度葡萄糖对Müller细胞P2Y2受体的影响:将经纯化培养至3-4代的Müller细胞在无血清培养基内培养24 h后,分别在对照组(5.5mmol/L葡萄糖)与高糖组(10, 25和50mmol/L)中孵育24h和72h,通过免疫荧光的荧光强度半定量分析检测Müller细胞中P2Y2受体的变化。3.苏拉明对高糖环境中Müller细胞iNOS的影响:将经纯化培养至3-4代的Müller细胞在5%胎牛血清培养基内培养24 h后,分别在对照组( 5.5mmol/L葡萄糖)与高糖+苏拉明组( 25+0, 25+0.05和25+0.1<mmol/L+g/L>)中孵育24 h和72 h,通过测定免疫组化染色的光密度半定量分析检测Müller细胞中iNOS的变化。结果1.纯化培养至第3-4代的Müller细胞,经鉴定表达GFAP和GS,纯度大于90%,活性大于90%。2.在24 h,10,25和50mmol/L组的P2Y2受体免疫荧光染色的荧光强度分别为31.05±7.06,59.17±11.42,84.11±12.72,与对照组(26.60±5.15)相比均有明显增高(P<0.01)。在72 h, 25和50mmol/L组的荧光强度分别为75.34±11.26,96.43±15.55,与对照组(26.91±4.88)相比较均有明显增高(P<0.01),但10mmol/L组(26.24±5.40)与对照组比较没有显著性差异(P=0.574)。两个时间点的数据间相比较总体上有显著性差异(F=92.439, P<0.01)。3.单纯高糖处理组(25mmol/L)与对照组(5.5mmol/L)相比,细胞形态没有发生明显的变化。苏拉明干预组贴壁细胞的形态与对照组相比变化不大,但间隙较对照组逐渐增大,并且漂浮细胞明显增多。免疫组化染色结果可见除对照组、25+0.05(24 h)及25+0.1(24 h)组外其他处理组细胞胞浆内有程度不同的iNOS阳性染色。在24 h,25+0组免疫组化染色光密度(110.03±71.92)与对照组(90.70±44.14)之间相比是增加的(P<0.01),25+0.05(91.58±41.22)和25+0.1组(104.94±45.53)与对照组之间相比较没有显著差异(P值分别为0.884和0.018)。在72 h,25+0,25+0.05,25+0.1组的光密度分别为283.83±143.48,133.69±99.51和113.88±55.41,各处理组与对照组(63.79±28.10)相比较均有增加(P<0.01)。两个时间点的数据间相比较总体上有显著性差异(F=103.709, P<0.01)。结论1.高浓度葡萄糖能够上调体外培养的Müller细胞中P2Y2受体的表达。2.P2受体非特异性抑制剂苏拉明能够下调高糖状态下Müller细胞iNOS的表达。说明某些嘌呤受体亚型可能参与并促进了糖尿病视网膜病变的发展过程。本试验创新点:初步研究了高糖条件下嘌呤受体亚型P2Y2在体外培养的Müller细胞中表达的变化,及P2受体非特异性抑制剂苏拉明对高糖刺激的体外培养的Müller细胞中iNOS表达的影响,该研究在国内外尚未见报道。