研究背景和目的:子宫内膜容受性是胚胎成功植入的必要条件之一,改善子宫内膜容受性是辅助生殖技术（ART）临床上提高体外受精（IVF）、单精子卵母细胞胞质注射（ICSI）—胚胎移植（IVF/ICSI-ET）的种植率和妊娠率的关键,对于提高人工授精及自然妊娠的成功率也非常重要。学者们认为,控制性超排卵可能改变了子宫内膜容受性、影响种植率。本课题组前期应用高通量定量蛋白质组学同位素标记相对和绝对定量（i TRAQ）分析,发现在不同控制性促超排卵方案患者种植窗期的子宫内膜存在明显的蛋白差异化表达,氨肽酶N（ANPEP/APN/CD13）是其中一个功能性蛋白,具有多重细胞生物学功能,进一步的生物信息学分析认为其可能是参与调控子宫内膜容受性的潜在靶蛋白。氨肽酶N在调控子宫内膜容受性发挥的作用,特别是在ART促排卵-胚胎移植的关键性作用及其机制尚属空白。本文以ANPEP为切入点,旨在研究子宫内膜容受性调控机制。ANPEP是一种膜结合锌依赖性肽酶,属于金属基质蛋白酶M1家族,其选择性表达于人脐静脉内皮细胞和肿瘤、实体瘤等组织中新生血管内皮细胞中,在正常组织血管内皮细胞不表达,被认为是新生血管形成重要调节因子。缺氧、血管内皮生长因子（VEGF）等血管生成信号均可以诱导新生血管内皮细胞中ANPEP的表达,ANPEP在新生血管形成的过程中,亦参与新生血管的发生并可调节血管生成信号。子宫内膜的血管系统的变化在参与调节子宫内膜容受性以及胚胎植入、着床过程中的重要性已被广泛证实,可以观察到的最初现象是着床点附近子宫内膜血管通透性以及微血管密度的增加。因此我们提出,ANPEP可能通过影响局部血管形成调节子宫内膜容受性。本研究以人原代子宫内膜间质细胞及人脐静脉内皮细胞系体外培养技术为基础,采用腺病毒载体感染手段调节子宫内膜间质细胞ANPEP表达水平,探讨子宫内膜间质细胞ANPEP蛋白表达对内膜容受性相关因子表达的影响,以及对内皮细胞增殖、迁移、血管腔形成功能的作用,初步探讨其参与调节子宫内膜容受性的调节机制,为辅助生殖技术中改善子宫内膜容受性从而提高胚胎种植率及妊娠率提供新的思路。材料与方法:1)免疫组化及蛋白质印迹（Western blot）方法测定ANPEP蛋白在1周龄、8周龄、8月龄不同年龄段小鼠子宫内膜组织以及增生期、种植窗前期、种植窗期人类子宫内膜组织中的定位及表达。2)分离培养人子宫内膜间质细胞原代细胞,免疫荧光鉴定细胞纯度;通过腺病毒感染调节原代培养的子宫内膜间质细胞中ANPEP的表达,应用实时定量逆转录聚合酶链反应（Real time RT-PCR）和Western blot方法在基因及蛋白水平验证腺病毒ANPEP过表达和干扰的有效性。3)通过过表达/干扰腺病毒感染调节原代培养的子宫内膜间质细胞中ANPEP的表达后,CCK-8实验观察子宫内膜间质细胞增殖活力、Transwell实验观察细胞迁移、侵袭能力的改变。4)将脐静脉内皮细胞（HUVECs）与过表达/干扰腺腺病毒感染后的子宫内膜间质细胞利用Transwell小室共培养,观察HUVECs迁移、侵袭能力的改变;用过表达/干扰腺病毒感染后的子宫内膜间质细胞培养液上清培养HUVECs,观察HUVECs增殖活力及管腔形成能力。5)通过过表达/干扰腺病毒感染调节原代培养的子宫内膜间质细胞中ANPEP的表达后,Real time RT-PCR检测子宫内膜容受性因子:HOXA10、intergrinβ3、LIF、IL-1的m RNA水平。6)通过过表达/干扰腺病毒感染调节原代培养的子宫内膜间质细胞中ANPEP的表达后,Real time RT-PCR检测侵袭相关蛋白金属基质蛋白酶MMP-2、MMP-9的m RNA水平。7)通过过表达/干扰腺病毒感染调节原代培养的子宫内膜间质细胞中ANPEP的表达后,Real time RT-PCR检测血管生成通路因子VEGF、VEGFR-2、PI3K及AKT的m RNA水平。8)统计学方法:SPSS 17.0软件进行统计学处理,数据以均数±标准差（Means±SD）表示。P<0.05为统计学有显著性差异。结果:1)各年龄段小鼠子宫内膜均表达ANPEP蛋白,在幼龄组最低,性成熟组最高;而后随着年龄的增长,ANPEP的表达随着生育能力的衰退而下降（P<0.05）。ANPEP蛋白在人类生殖周期各阶段子宫内膜间质细胞中均表达,种植窗期组表达较增生期组及种植窗前期组明显增强（P<0.05）。2)原代培养的子宫内膜间质细胞可传代、冻存及复苏,对2-3代细胞进行免疫荧光检测,结果显示培养的细胞波形蛋白表达阳性而角蛋白呈阴性,细胞纯度良好;腺病毒感染可成功对其ANPEP蛋白的表达在基因和蛋白水平进行过表达和降低表达的调节,可进行后续功能研究。3)子宫内膜间质细胞的增殖、迁移和侵袭能力随ANPEP过表达而增强,随其下调而减弱（P<0.05）。4)随子宫内膜间质细胞的ANPEP表达上调,与之共培养的HUVECs的迁移和侵袭能力增加,反之下降（P<0.05）;用其培养液上清培养的HUVECs增殖活力、管腔形成能力随h EMSCs的ANPEP表达上调而增强,反之下降（P<0.05）。5)子宫内膜间质细胞的ANPEP表达上调,促进了子宫内膜容受性因子HOXA10、intergrinβ3、LIF的表达（P<0.05）,而IL-1的升高趋势无统计学意义（P>0.05）;下调h EMSCs的ANPEP表达,HOXA10、intergrinβ3、LIF的表达下降（P<0.05）,而IL-1无明显改变（P>0.05）。6)上调子宫内膜间质细胞的ANPEP表达,金属基质蛋白酶MMP-2、MMP-9的表达上调（P<0.05）;下调h EMSCs的ANPEP表达,MMP-2、MMP-9表达下降（P<0.05）。7)子宫内膜间质细胞的ANPEP表达可增加血管生成通路因子VEGF、VEGFR-2及PI3K、AKT的表达（P<0.05）;h EMSCs的ANPEP表达下调可引起VEGF、VEGFR-2及PI3K、AKT表达下降（P<0.05）。结论:1.ANPEP在小鼠和人的子宫内膜均有表达,且在生殖能力较高的阶段高表达;在种植窗期较增生期表达明显增强,提示ANPEP参与调节子宫内膜容受性,对胚胎种植和妊娠维持可能起重要作用;2.子宫内膜间质细胞中ANPEP的表达可促进HOXA10、intergrinβ3、LIF等内膜容受性因子的表达,从而影响内膜容受性;3.子宫间质细胞的ANPEP的上调促进其增殖、迁移、侵袭能力,并增加内皮细胞的增殖、迁移和侵袭能力,上调金属基质蛋白酶MMPs及PI3K、AKT的表达可能是其调节机制;4.子宫内膜间质细胞中ANPEP的表达可促进内皮细胞成管能力,从而影响子宫内膜局部微血管形成而参与调节内膜容受性,上调VEGF及其受体的表达可能是其发挥作用的机制之一。