【摘 要】
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目的研究分化抑制因子2（Inhibitor of differentiation 2,Id2）对结肠癌细胞HCT116增殖和侵袭转移相关能力的影响,并探讨可能的作用机制。方法选取HCT116、HT29、SW480、SW620、LoVo、CaCo2六株结直肠癌细胞,提取细胞总蛋白和RNA进行Western blot和q RT-PCR实验,比较肠癌细胞中Id2蛋白和mRNA的表达情况,选取出Id2表达
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目的研究分化抑制因子2（Inhibitor of differentiation 2,Id2）对结肠癌细胞HCT116增殖和侵袭转移相关能力的影响,并探讨可能的作用机制。方法选取HCT116、HT29、SW480、SW620、LoVo、CaCo2六株结直肠癌细胞,提取细胞总蛋白和RNA进行Western blot和q RT-PCR实验,比较肠癌细胞中Id2蛋白和mRNA的表达情况,选取出Id2表达量最高的肠癌细胞株HCT116。应用shId2质粒瞬时转染HCT116构建实验组细胞株HCT116-shId2（以HCT116-shcon细胞为阴性对照组）,48h后观察绿荧光表达,判断转染效率。同时应用Western blot和q RT-PCR分析Id2受抑制情况。接着应用实时无标记细胞分析系统（RTCA）观察Id2敲减后HCT116增殖曲线的变化,并应用克隆形成实验分析细胞克隆形成能力的改变;流式细胞术检测细胞周期;划痕试验、Transwell迁移及侵袭实验检测细胞迁移和侵袭能力的改变;Western blot检测增殖相关蛋白、转移相关蛋白表达的改变。结果1、在六株结直肠癌细胞中,HCT116细胞Id2蛋白和和mRNA的表达均呈现出较高的表达水平;2、由细胞增殖曲线可以看出,敲减Id2后HCT116细胞生长明显受抑制（p<0.05）。Id2敲减组细胞HCT116-shId2-7的克隆数（49.7±11.0个）比对照组细胞HCT116-shcon的克隆数（150.7±17.4个）明显减少（p<0.05）,且克隆团大小也明显变小。说明敲减Id2后,HCT116细胞克隆形成受到明显抑制;应用流式细胞术检测细胞周期发现,HCT116-shcon和HCT116-shId2的G0/G1期细胞所占比例分别为45.17%±2.5%和52.52%±2.65%（p<0.05）;S期细胞所占比例分别为36.93%±1.71%和30.63%±1.45%（p<0.01）,G2/M期细胞所占比例分别为17.99%±4.06%和16.84%±3.49%（p>0.05）。可见敲减Id2后HCT116细胞中G0/G1期比例明显升高,S期细胞比例相应下降;进一步分析显示,细胞周期蛋白CyclinB和CyclinD1表达下调。说明Id2通过抑制CyclinB和CyclinD1表达,使HCT116细胞周期阻滞于G0/G1期,细胞生长受抑制;3、划痕实验结果显示,培养24h后HCT116-shcon组和HCT116-shId2-7组的愈合率分别为75.3%±8.1%和为35.5%±9.7%,两组有显著差异（p<0.05）。由Transwell迁移实验可知,培养48h后HCT116-shId2-7组穿膜细胞数（109.0±11.1个）比HCT116-shcon组（155.3±7.6个）显著减少（p<0.05）。Transwell侵袭实验中HCT116-shcon组和HCT116-shId2-7组的穿膜细胞数分别为75.3±12.6个和46.7±6.0个（p<0.05）。可见敲减Id2后HCT116细胞迁移及侵袭能力都显著降低,且侵袭转移相关蛋白MMP2表达明显下调,TIMP1表达明显上调,MMP7、MMP9未见改变。结论1、敲减Id2后,HCT116细胞中CyclinB和CyclinD1的表达受抑制,削弱肠癌细胞的增殖能力;2、敲减Id2可下调HCT116细胞中MMP2的水平,同时上调TIMP1进而抑制HCT116细胞的迁移和侵袭。
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