维管组织在植物的各个组织中都起着重要作用,主要体现在物质运输、机械支持和形态发育等相关功能;在木本植物中,维管组织的生长促进植物茎干的伸长和加粗,为木材的材质提供支持。随着杨树全基因组测序的完成,能够更清楚的了解参与木本植物维管组织生长相关的基因;在转录组数据分析的深入,大家逐渐了解了一些非编码RNA在维管发育中的作用。NAT作为一类非编码RNA在植物中的作用也渐渐被人们所重视,NAT在自然界中广泛存在,在物种进化中具有较高的保守性,参与植物生长发育和抗逆性调控,同时与某些疾病的发生有着直接和间接的联系;本课题基于黑杨转录测序,找到大量与维管发育相关的NAT对,通过数据分析和定量分析最终确定了AP-1/Novel01360这对NAT进行产生机制和功能进行了实验分析。此外,樟树作为一类高大乔木具有发达的维管系统,是重要的木材和工业原料,但是由于其基因组的不完全和没有完善的转化体系限制了其功能基因的研究;本课题基于樟树转录组数据分析,筛选出大量樟树的CLE和WOX基因,通过实验探究参与樟树胚性愈伤组织增殖候选基因的挖掘。首先,在AP-1/Novel01360这对NAT的研究中,本研究对Novel01360的来源和形成进行了初步的探究。在对Novel01360进行5’/3’RACE实验时,发现Novel01360的5’RACE结果在一定长度处富集;于是对AP-1的3’端进行RACE实验,同样发现AP-1基因的3’RACE结果也同样在一定长度处富集,序列比对后发现长度与Novel01360的5’RACE结果相同,说明Novel01360完全来源于AP-1基因,从实验结果来看Novel01360为cis-NAT。在探究Novel01360的形成机制时,将其AP-1基因分成三段进行克隆,分别为:AP-1＿CDS-OE、AP-1＿H-OE、AP-1＿H-3’UTR-OE,在烟草瞬时表达和拟南芥转基因中发现当AP-1与Novel01360存在互补区域时就能产生相应互补区域的NAT片段,说明Novel01360的产生完全由其正义链序列转录而来。对于AP-1/Novel01360的功能和作用机理的探究以及木本植物中的形成机制,本研究将AP-1＿CDS-OE、AP-1＿H-OE、AP-1＿H-3’UTR-OE和Novel01360-OE等3个超表达构建转入杨树中进行验证。其次,在对樟树CLE基因参与胚性愈伤组织增殖候选基因的挖掘,本课题基于张翠杰实验结果进行后续工作开展。实验发现NAA处理樟树胚性愈伤组织后,樟树愈伤组织生长速度优于未加入NAA的樟树愈伤且生长状态好;于是使用NAA液培处理樟树愈伤24 h,然后对樟树19个CcCLE和14个CcWOX基因进行荧光定量分析,发现CcCLE1与未加NAA成极显著差异,于是猜测NAA对樟树胚性愈伤组织的增殖影响可能通过CcCLE1基因来行驶功能,而CcWOX定量结果显示部分基因上调,可能有部分基因参与其中的表达。后续实验中合成CcCLE1p和CcCLE1p-P9A多肽,并液培处理樟树胚性愈伤,增殖率结果显示CcCLE1基因抑制樟树胚性愈伤组织的增殖,而定量结果显示CcCLE1基因几乎抑制所有CcWOX基因的表达,这种机理的出现说明NAA对樟树胚性愈伤组织增殖的影响可能通过CcCLE1基因来调节,而CcCLE1基因通过影响相应CcWOX的表达量来行使其功能。本课题基于杨树转录分析和实验筛选获得候选NAT对,研究中对NAT的来源和形成机制进行了验证,但是对于其功能和作用机制的研究目前还未完善,未来实验室将会继续展开研究。在樟树的研究中,对NAA处理后樟树愈伤组织的作用机制进行了初步探究,但是由于转录组获得的候选基因数量有限,这对本研究带来一定困难,后续我们会针对现有结果进行深入探究。