桂花（Osmanthus fragrans Lour.）是木犀科木犀属的树种,是中国传统十大名花之一。桂花因其优美的树型和独特的香味受到人们的喜爱,并被广泛应用于园林造景中。根据桂花的分类标准-花期与花色的差异,分为四季桂、金桂、银桂和丹桂四个不同的品种群,其中丹桂颜色最深呈橙色-橙红色,银桂颜色最浅呈白色-白黄色。目前已有研究表明桂花花瓣中的类胡萝卜素含量会影响桂花花瓣的着色,但对于桂花花瓣成色的分子机理研究较少。本实验通过2-（4-氯苯硫基）三乙胺盐酸盐（CPTA）对银桂花枝的外源处理,结果发现花瓣颜色明显变化,对变色花瓣进行类胡萝卜素的测定和类胡萝卜素代谢路径关键基因的定量检测,结合转录组数据分析经CPTA处理后类胡萝卜素代谢路径关键基因的变化,及其与检测到的类胡萝卜素含量间的相关性。同时,在本研究在课题组前期工作的基础上,对桂花子胚胚性愈伤诱导和继代培养基进行了抗褐化条件的摸索,并继续对桂花胚性愈伤组织进行农杆菌转化条件的优化。主要研究成果如下:1.桂花胚性愈伤诱导和继代培养中降低褐化率根据邹晶晶（2014）对金桂果实的分类标准,选择阶段3的金桂合子胚为材料,设计不同生长素和细胞分裂素组合的胚性愈伤诱导培养基,发现0.5mg/L NAA+1.0mg/L KT的浓度组合胚性愈伤诱导率达到73%,在初代诱导30d的培养周期结束后褐化率仅为3%。对继代培养基中光照周期和基本培养基种类进行设计,结果表明在黑暗条件下培养可以保持胚性愈伤组织的胚性,而换用MT培养基使得胚性愈伤呈松散型,褐化率降低。同时,对继代培养基中添加不同种类抗褐化剂,结果表明向培养基中添加0.04g/L的柠檬酸和0.06g/L、0.08g/L的VC,褐化率低于10%。2.农杆菌转化条件优化以诱导得到的胚性愈伤组织为农杆菌侵染对象,卡那霉素的选择敏感浓度在100-150mg/L范围内,头孢霉素的敏感浓度在200-300mg/L的范围内。GUS瞬时表达的结果表明:农杆菌菌株为EHA105时,AS浓度为200mg/L、预培养天数为1d时,瞬时侵染效率较高;当侵染菌液浓度OD600值为0.6,共培养天数为6d时,返菌率低,瞬时侵染效率较高。筛选培养基中添加150mg/L Km+200mg/L Cef,无返菌现象发生,但愈伤组织生长缓慢。3.CPTA处理后类胡萝卜素含量HPLC分析使用0.2g/L和0.4g/L CPTA溶液浸泡24h后,接近液面处花瓣颜色发生变化;浸泡36h后,颜色变化明显。通过对花瓣的类胡萝卜素提取和HPLC分析,结果表明,CPTA-0.2g/L-24h组中β-胡萝卜素含量高达1206ug/g DW,而对应的CK-24h组中β-胡萝卜素含量仅为368ug/g DW;并且番茄红素在CK组各时间段的含量极低,而在CPTA-0.2g/L-24h组中含量高达775ug/g DW。并且像δ-胡萝卜素和γ-胡萝卜素在CK组检测不到或含量极低的情况下,CPTA-0.2g/L-24h组中对应时间段两种类胡萝卜素有明显增加。4.类胡萝卜素代谢路径关键基因的表达水平分析在番茄红素合成上游的几个基因中,CPTA-0.2g/L-12h组中Of PSY和Of ZDS的基因表达量比CK-12h组高,CK-36h组中Of PDS1、Of PDS2、Of ZISO、Of ZDS和Of CRISO基因表达量比CPTA-0.2g/L-36h组高并且差异显著,其它时间段两组间各基因表达量差异不明显。在番茄红素开始环化下游的几个基因中,CPTA-0.2g/L-12h对比CK-12h组,Of LCYE、Of LCYB1、Of CHYE、Of CHYB、Of ZEP和NCED1的表达量都是增加的,其中Of LCYE、Of LCYB1、Of CHYE和Of NCED1的表达量增加差异显著;达到24h时,CPTA-0.2g/L-24h与CK-24h相比,Of LCYE、Of LCYB2、Of CHYE、Of CHYB、Of ZEP的表达量是增加的,其中Of LCYE、Of LCYB2、Of ZEP的表达量增加差异显著;达到36h时,除Of NCED1外,CK-36h组较CPTA-0.2g/L-36h组的基因表达量高,差异显著。5.转录组数据分析根据转录组数据对类胡萝卜素代谢关键基因进行筛选得到潜在的各关键基因的转录本ID和序列,对筛选得到的各关键基因结合q RT-PCR结果和类胡萝卜素含量的结果分别进行了热图和相关性的分析,发现在热图中,CK与CPTA-0.2g/L两组间各时间段的差异并不明显。另一方面,转录组数据和类胡萝卜素含量之间的相关性分析发现,筛选的得到的关键基因和检测到的6种类胡萝卜素间有一定的相关性,但每种类胡萝卜素含量的变化与不同的基因间相关性并不一致。