柠檬酸作为一种有机酸,是很多固体饮料和液体饮料不可缺少的配料之一。除在食品行业的应用,已经被广泛地应用在现代农业、工业、纺织业等各个领域。柠檬酸一般是通过液体发酵获得的,在发酵过程中用到的菌株是黑曲霉。研究表明黑曲霉的不同形态对柠檬酸的产量会造成很大影响,在黑曲霉菌丝呈现为球状形态时,可以大量积累柠檬酸,几乎不产生酶制剂。为了获得柠檬酸高产菌株,需要通过分子手段对黑曲霉进行改造。有研究报道brsa-25基因可以控制黑曲霉的菌丝形态,使黑曲霉菌丝更容易形成分散的丝状,不利于柠檬酸的积累。本研究希望通过同源重组的原理,敲除黑曲霉基因组上的brsa-25基因,达到破坏基因功能的目的,研究结论如下:1.利用重叠PCR的原理,通过对PCR反应程序的优化,成功地将黑曲霉brsa-25基因的上游同源臂、潮霉素抗性基因表达盒、黑曲霉brsa-25基因的下游同源臂连接在一起。2.利用Infution酶,成功地将构建好的同源重组基因片段连接在T载体上面。这种连接方法与传统的T-A连接方法相比较,不仅连接效率高,而且时间周期短。3.首次通过脂质体转化的方法,将构建的同源重组基因片段转化并整合到黑曲霉基因组中。4.利用电转化的方法,成功地将同源重组基因片段转化进黑曲霉孢子中,且得到插入位置正确的转化子,为下一步发酵做好了准备。