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体细胞核移植同ES 细胞研究与组织工程相结合,诞生治疗性克隆的新疗法,修复人体病变的组织或器官,不仅可以解决移植物与受体间的免疫排斥反应问题,还可以解决移植物的来源问题。本次研究通过对体细胞核移植克隆胚适宜构建条件、激活方法、不同供体细胞在体细胞核移植中的应用、ES 细胞的适宜分离方法、克隆胚ES 细胞的分离培养、诱导分化等进行系列研究,为人类治疗性克隆的临床应用积累知识和经验。1、小鼠卵母细胞经乙醇和氯化锶激活同小鼠输卵管上皮细胞饲养层共培养,胚胎发育较为一致,卵裂均匀;小鼠孤雌胚的激活率乙醇加饲养层组最高97.15 %;小鼠孤雌胚的2-细胞率乙醇加饲养层组最高93.14 %;小鼠孤雌胚的桑椹胚率乙醇加饲养层组最高80.38 %;小鼠孤雌胚的囊胚率氯化锶加饲养层组最高76.21 %;孤雌胚的ICM 孵出率氯化锶加饲养层组最高75.28 %;孤雌胚ES 细胞孵出率氯化锶加饲养层组最高29.21 %,同乙醇加饲养层组、氯化锶组之间差异极显著(p<0.01)。表明氯化锶激活的昆明小鼠孤雌胚体外具有较强的发育能力。2、LIF 和大鼠心肌条件培养基在小鼠ES 细胞分离培养过程中,昆明小鼠ICM 孵出率心肌条件培养基为76.30 %,LIF 条件液为59.35 %,两者差异极显著(p<0.01); LIF条件液比心肌条件培养基能较早地分离出小鼠ICM,平均时间差为11.2 h;ES 细胞集落培养48 h时周边出现分化现象的集落所占比例在心肌条件培养基中为51.55 %, LIF条件液中为31.69 %, 两者差异极显著(p<0.01);第5 代小鼠ES 细胞核型正常率在心肌细胞条件培养基中为78.60 %,稍高于LIF 条件液中的76.00 %。表明大鼠心肌条件培养基较LIF 条件液更能成功分离培养昆明小鼠ES 细胞。3、小鼠在注射hCG 后14～16 h 间进行去核,去核成功率最高80.09 %;注射hCG后的20～22 h 间去核的卵母细胞,重构胚激活率最高85.14 %;注射hCG 后14～16 h去核重构胚囊胚率最高13.94 %,同16～18 h 间的差异显著(p< 0.05),同18～20 h、20～22 h 间的差异极显著(p< 0.01)。表明小鼠卵母细胞适宜在注射hCG 后14～16 h 间进行去核。4、小鼠卵丘细胞核移植重构胚氯化锶加饲养层组325 枚,195 枚发育到2-细胞阶段,71 枚发育到桑椹胚阶段,38 枚发育到囊胚阶段,9 枚重构囊胚分离出ES 细胞,5枚囊胚分离的ES 细胞集落可稳定传代;分离出ES 细胞集落呈鸟巢状突起,生长旺盛的ES 细胞集落周围可见到分化的上皮样或梭形细胞;ES 细胞碱性磷酸酶染色强阳性;体外形成类胚体。核移植重构胚氯化锶组289 枚,162 枚重构胚发育到2-细胞阶段,10