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本论文工作的重点是一种高尔基体相关蛋白质——GOPC的PDZ结构域的克隆、表达纯化、溶液结构以及功能研究。我们克隆、表达和纯化了人GOPC蛋白的PDZ结构域;用核磁共振波谱学的方法测定了这个结构域的溶液结构;运用NMR化学扰动实验对人GOPC蛋白的PDZ结构域与Neuroligin和Frizzled8 C-末端多肽之间的相互作用进行了研究。我们还克隆、表达和纯化了人AREB6蛋白的Homeobox结构域,对该结构域的表达条件进行了初步探讨,并应用光谱学的方法研究该蛋白质的二级结构。
论文整体分为三部分。第一部分第一章是对GOPC蛋白生理功能的综述。GOPC是最早发现的定位于高尔基体的PDZ包含蛋白之一,在不同组织中广泛表达。GOPC蛋白在细胞信号调节、细胞自吞噬作用和细胞凋亡途径调控、神经突形成过程的调控等诸多生物学过程中具有重要角色,并能够与诸如TC10,CFTR,frizzled,CALEB/NGC,Golgin-160,β1AR,Neuroligin等许多生物大分子相互作用。GOPC的缺失和突变会导致许多遗传疾病。GOPC基因很可能是一个管家基因。第二章综述了Neuroligin的生物学功能。Neuroligin具有高度保守的C末端序列,是典型的单跨膜蛋白。Neuroligin能与许多蛋白质分子如β-neurexins、突触支架分子(SSCAM)、PSD-95等相互作用,从而在触发突触前膜发育,诱导突触的形成、重塑、成熟,调控兴奋性/抑制性突触的比例等生物学过程中发挥重要作用。Neuroligin的突变会导致某些疾病的发生。
论文第二部分利用核磁共振波谱学测定了人GOPC蛋白的PDZ结构域的溶液结构,并对该结构域与Neuroligin和Frizzled 8 C-末端多肽的结合性质进行了研究。编码人GOPC PDZ结构域的基因在大肠杆菌中得到了克隆和表达,利用Ni离子亲和层析法获得可用于核磁实验的重组蛋白质。GOPC蛋白的PDZ结构域具有PDZ结构域家族典型的结构特征:六段反平行的β折叠和两段α螺旋。动力学分析表明,溶液中GOPC蛋白的PDZ结构域在303K时主要以单体形式存在,但在温度降低时有形成聚合体的趋势。利用化学位移扰动实验研究了GOPC蛋白的PDZ结构域与Neuroligin和Frizzled C-末端多肽的结合性质。Neuroligin以及人Frizzled 8 C-末端多肽与GOPC PDZ结构域的作用位点都位于βB和αB螺旋形成的沟中。在NMR的时间尺度上,GOPC PDZ结构域与NeuroliginC-末端多肽的相互作用形成的复合物在整体上属于快速交换的范畴,与人Frizzled 8 C-末端多肽相互作用属于中等强度的相互作用。通过NMR滴定动力学计算出GOPC PDZ结构域与Neuroligin C-末端多肽相互作用的解离常数为260±86μM。我们运用分子动力学模拟的方法,构建了GOPC PDZ结构域与Neuroligin C-末端多肽相互作用的三维结构模型,该模型能很好的解释化学干扰实验的结果。
第三部分是关于人AREB6 Homeobox结构域的表达、纯化及二级结构的初步研究。AREB6是一种同时具有锌指和Homeobox的转录因子。人AREB6的Homeobox结构域在大肠杆菌中得到了克隆和表达。我们对其表达和纯化条件进行了研究,并利用圆二色谱(CD)研究了其二级结构。