克伦特罗(clenbuterol，CBL)是一种禁用的动物促长剂，但违禁使用现象仍较普遍，危害严重，有必要进一步对其加强监测。免疫分析法具有灵敏、简便、快速等特点，在食品安全监测中具有突出的优势。目前虽有利用CBL多克隆抗体及单克隆抗体建立的免疫分析方法，但其抗体制备需要进行动物免疫及昂贵的细胞培养设备，周期长，成本较高，限制了其在免疫分析中的应用。第三代抗体——基因工程抗体技术的出现，给快速低成本制备目的抗体提高了一条新的途径。为此，本论文开展抗CBL单链抗体制备、表达及特性研究，主要研究内容及结果如下： 1抗CBL噬菌体单链抗体库构建、特异性噬菌体抗体筛选及鉴定 从1×107抗CBL杂交瘤细胞系5D1中采用Trizol法提取总RNA，经紫外分光光度法测定含量为2μg/μL，A260nm/A280nm值约为2.12，纯度较好。以此RNA为模板，OligodT9为引物，进行反转录反应，合成cDNA第一链。以此cDNA第一链为模板，采用一套通用引物，PCR分别扩增抗体轻重链可变区VL、VH基因，结果分别扩增出320bp的VL基因片段及350bp的VH基因片段。以扩增出的VH、VL片段互为模板，采用一套含(Gly4Ser)3连接肽的接头引物，重叠延伸PCR法合成scFv单链抗体基因片段，并采用两条含BglⅠ及NotⅠ酶切位点的上下游引物对scFv进行二次PCR扩增，结果扩增出760bp的全长scFv基因片段。将scFv片段用BglⅠ及NotⅠ双酶切后，与载体pCANTAB5E连接，转化大肠杆菌TG1，产生约2.26×103个克隆，即抗体库的库容为2.26×103。从转化平板上挑取8个克隆进行PCR及酶切鉴定，结果表明有6个克隆含有插入片段，即重组率为75％。采用辅助噬菌体对转化菌进行超感染后，构建抗CBL噬菌体抗体库。以CBL-OVA为包被抗原，对抗体库进行一轮富集淘选，从富集后的生长平板上挑取32个克隆，PCR鉴定13个克隆含有插入片段。采用抗M13抗体对此13个噬菌体抗体克隆进行ELISA鉴定，结果全部克隆显示出抗原结合活性。而从富集前的平板上挑选的16个克隆，PCR鉴定有8个克隆含有插入片段，只有1个噬菌体抗体克隆显示出抗原结合活性。 2抗体CBL单链抗体可溶性表达及性质鉴定 从上面鉴定为阳性的克隆中提取质粒DNA，转化琥珀终止非抑制型大肠杆菌HB2151，IPTG诱导抗CBL单链抗体进行可溶性表达。采用渗透休克法提取了菌体细胞周质腔中的可溶性单链抗体，并对培养上清及周质腔提取物中表达的单链抗体进行SDS-PAGE，Western-Blotting及ELISA鉴定。SDS-PAGE结果显示，周质腔提取物在分子量29kD处明显出现一增粗条带，与单链抗体的预期分子量相符，表明可溶性单链抗体在菌体周质腔中有表达。而Western-Blotting的结果则发现培养上清及周质腔提取物均出现特异性条带，表明可溶性单链抗体在培养上清及周质腔中均有表达。间接ELISA分析也表明类似结果。培养上清的效价约为1:160，周质腔的效价约为1:1600。竞争ELISA分析结果表明，表达的可溶性单链抗体可被游离的CBL竞争性抑制，IC50值为0.78ng/mL，比亲本单抗(IC50值为1.34ng/mL)要低，表明在竞争ELISA分析中单链抗体可能比单克隆抗体要有更高的灵敏度。交叉反应测定结果表明，抗CBL单链抗体与CBL系列结构类似物不存在交叉反应，与亲本单克隆抗体结果一致，表明了此单链抗体具有与亲本单抗结构相同的抗原结合位点。以抗CBL单链抗体为免疫试剂，初步建立了CBL的竞争ELISA分析法。从标准曲线上可见，线性分析范围在0.14～10.2ng/mL，最低检测限为0.06ng/mL。对一系列标准添加物进行测定，结果表明在PBS中添加标准物，具有较好的准确率。 3抗CBL单链抗体生物信息学初步研究 采用ABI3730测序仪对抗CBL单链抗体的基因序列进行测定，并根据基因序列推导了其氨基酸序列。根据Kabat法则分别对VH、VL的FR区及CDR区进行了划分。在NCBI数据库中采用ProteinBLAST选项分别对VH、VL及全长scFv进行了序列同源性比对，结果发现VH序列与一转基因小鼠产生的VH序列(序列号：AAO19048.1)高度同源，同源性为86％，有14个氨基酸不同。其中，1个在CDR1区，4个在CDR2区，3个在CDR3区。VL序列与一抗PVYNIa蛋白单链抗体的VL序列(序列号：AAO43673.1)高度同源，同源性为91％，有9个氨基酸不同。其中，1个在CDR1区，2个在CDR3区。以scFv全长氨基酸序列作为比对模板，则发现与一抗isoketal-adduct半抗原的单链抗体序列(序列号：AAW28931.1)高度同源，同源性为84％，有37个氨基酸不同。其中，1个在VH的CDR1区，4个在VH的CDR2区，7个在VH的CDR3区，2个在VL的CDR1区，3个在VL的CDR3区。从在CDR区发生变异的氨基酸分布看，变异氨基酸主要出现在VH的CDR2、CDR3区及VL的CDR1、CDR3区，提示这4个区的氨基酸组成可能与抗体识别CBL抗原密切相关。对抗CBL单链抗体的部分物理化学性质进行了预测，结果表明此单链抗体的分子量为25826.6，等电点为8.78。二级结构预测表明此单链抗体含α螺旋20处，β折叠99处，β转角28处，随机卷曲93处。根据同源建模法对抗CBL单链抗体进行了三维结构模拟，结果表明此单链抗体的三维模拟图符合典型scFv的结构，可观察到抗体可变区的6个环区(CDR区)及形成的抗原结合位点。