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目的BPA作为环境内分泌干扰物的代表性物质,其对生物体的生殖内分泌、神经、免疫毒性已被诸多研究所证实,依据动物实验及人群研究资料,美国FDA将BPA的NOAEL规定为5 mg/kg,而欧盟则规定为50μg/kg;许多研究结果显示,不同剂量的BPA会出现双向效应,即同一实验条件下,低剂量和高剂量的毒性效应不一致,其中机制不清。一般认为低剂量条件下BPA会出现拟内源性激素效应,高剂量会出现损伤效应。为探讨不同剂量BPA对雄性生殖是否会产生双向效应及其具体机制,本研究建立青春期染毒雄性大鼠动物模型,以类固醇性激素合成过程为观察指标,应用代谢组学及分子生物学相结合方法,研究不同剂量BPA在影响类固醇激素合成过程中的作用是否一致,探讨可能的机制,为深入研究环境内分泌干扰物的机体损伤提供新思路。方法3周龄雄性SD大鼠60只,适应性饲养1周后按体重随机分为6组,每组10只,即对照组、0.5μg/kg BPA、50.0μg/kg BPA、5.0 mg/kg BPA、50.0 mg/kg BPA及50.0μg/kg E2组,以5 ml/kg容积灌胃染毒,1次/天,7天/周,共4周,对照组给予等容积的溶剂玉米油。动物饲养条件为温度23℃±1℃,湿度55%±3%,人工12/12小时循环照明,自由饮水。染毒结束后水合氯醛麻醉、腹主动脉采血并分离血清备用,摘取相应脏器称重并于-80℃冻存。计算精子数目、睾丸脏器指数。利用ELISA检测大鼠血清中的T、E2,通过RT-PCR和Western blot检测类固醇激素功能和反馈调节因子ERα、ERβ、LHR、FSHR。HE染色观察睾丸病理学改变。使用UHPLC-Q-TOF-MS/MS进行生物样本的数据采集,采用Proteowizard和R-XCMS软件进行数据处理和分析。找到差异性化合物,根据其质谱信息与在线数据库进行化合物鉴定,进行生物标志物富集和代谢通路分析以确认不同剂量组的差异代谢物及不同代谢途径。通过RT-PCR和Western blot检测类固醇激素合成关键因子St AR、CYP11A1、CYP17A1、17βHSD、3βHSD、CYP19A1的m RNA和蛋白表达水平的变化。结果1.与对照组相比,各组大鼠体重增长无差异;0.5μg/kg BPA组睾丸脏器系数和5.0mg/kg BPA组精子数目显著降低（p＜0.05）。光镜病理学检测结果显示,0.5μg/kg BPA组曲细精管出现轻微萎缩,部分生精细胞消失,精子生成减少;5.0 mg/kg BPA组曲细精管萎缩,排列疏松,生精细胞层数变薄,精子生成减少。2.与对照组相比,0.5μg/kg BPA、50.0μg/kg BPA组睾酮显著下降（p＜0.05）,50.0mg/kg BPA组睾酮显著升高（p＜0.05）同时0.5μg/kg BPA、50.0μg/kg BPA剂量组的睾酮含量与E2组变化趋势相同,5.0 mg/kg BPA、50.0 mg/kg BPA剂量组的睾酮含量与E2组变化趋势相反。50.0μg/kg BPA组、5.0 mg/kg BPA组雌二醇含量显著升高（p＜0.05）,各剂量组的雌二醇含量与E2组变化趋势相同。3.0.5μg/kg BPA组与对照组相比,ERα的蛋白水平上升而ERβ基因的m RNA表达水平降低,同时FSHR的表达水平显著上升（p＜0.05）;与E2组相比,除ERα的蛋白水平与E2组表达变化趋势相反外,其余各指标均与E2组变化趋势相同。50.0μg/kg BPA组与对照组相比,在m RNA及蛋白水平降低了ERα的表达水平,以及降低了ERβ基因的m RNA表达水平,同时LHR的表达水平显著上升（p＜0.05）;与E2组相比,除LHR的m RNA水平与E2组表达变化趋势相反外,其余各指标均与E2组变化趋势相同。5.0 mg/kg BPA组与对照组相比,ERα的m RNA及蛋白水平降低,而ERβ的蛋白表达水平上升,同时FSHR的m RNA表达水平显著上升（p＜0.05）;各指标均与E2组趋势相同。50.0 mg/kg的剂量组与对照组相比,ERα的蛋白水平降低而ERβ的蛋白表达水平升高,同时LHR的表达水平显著降低（p＜0.05）;与E2组相比,除LHR的m RNA水平与E2组表达趋势相反外,其余各指标均与E2组趋势相同。4.通过非靶向代谢组学分析,以预设p＜0.05、VIP＞1的阈值从样品一级物质列表中寻找差异代谢物,在正离子模式下,检测到代谢产物6065种,发生改变的有2471种,其中上调的有1276种、下调的有1195种;在负离子模式下,共检测到7197种代谢物,发生改变的有2979种,其中上调1378种、下调1601种。以MS/MS碎片模式对Human Metabolome Database（HMDB）、massbank、Lipid Maps、mzclound等数据库确认注释获得代谢物。共鉴定得到差异代谢物459种,有显著改变的200种,其中上调87种、下调113种。利用KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）数据库和Met PA数据库,找出差异代谢通路。与对照组相比,0.5μg/kg BPA剂量组富集出62条代谢差异信号通路、5.0 mg/kg BPA剂量组富集出74条代谢差异信号通路,其中34条信号通路两个剂量组是相同的;5.0 mg/kg BPA剂量组与0.5μg/kg BPA剂量组相比,出现40条差异代谢通路,其中包括类固醇生成合成及类固醇激素合成通路。5.0.5μg/kg BPA剂量组中,与对照组相比,St AR、CYP11A1、CYP17A1、17βHSD2、CYP19A1的m RNA和蛋白表达均表达上升（p＜0.05）;与E2组相比,St AR、CYP11A1、CYP17A1、CYP19A1的m RNA水平及St AR、CYP17A1、CYP19A1、17βHSD2的蛋白水平表达与E2组趋势相同,其余各指标与E2组趋势相反。5.0 mg/kg BPA组与对照组相比,CYP11A1、17βHSD2的蛋白水平及St AR、3βHSD、17βHSD、CYP19A1的m RNA表达水平下降而St AR、CYP19A1的蛋白水平上升（p＜0.05）;与E2组相比,3βHSD的m RNA表达以及17βHSD2的蛋白表达水平与E2组变化趋势相反以外,其余各指标与E2组变化趋势相同。结论1、BPA染毒干扰大鼠的正常发育,导致大鼠睾丸发育不良,生精能力减弱;0.5μg/kg BPA、5.0 mg/kg BPA使睾丸曲细精管萎缩,生精细胞减少。同时BPA改变大鼠体内睾酮、雌二醇的分泌水平,0.5μg/kg BPA、50.0μg/kg BPA使睾酮含量上升而50.0mg/kg BPA使睾酮水平下降,50.0μg/kg BPA和5.0 mg/kg BPA使雌二醇表达上升。2、与其他剂量组相比,0.5μg/kg BPA对LHR的影响存在拟雌激素作用。3、不同剂量组大鼠代谢物质和代谢途径存在差异,主要差异代谢物雄烯二酮,差异代谢途径是类固醇生物合成及其激素生物合成过程。4、BPA对睾丸类固醇激素合成过程的调节存在复杂的剂量效应关系,存在低剂量刺激、高剂量抑制的双向调节;0.5μg/kg相较于5.0 mg/kg组,0.5μg/kg组对性激素合成基因的具有刺激效应,且与阳性对照组E2组变化趋势相同,呈现拟雌激素作用。而5.0 mg/kg组对睾丸的损伤主要是实质的损害作用。