研究背景外界环境中许多天然或合成的物质具有类雌激素样结构，可以产生拟内源性雌激素样效应，故被称为环境雌激素（Environmental Estrogens, EEs）。同时这些物质也扰乱机体内分泌系统的稳态，故又被称为环境内分泌干扰物（Environmental Endocrine Disruptors, EEDs）。塑料制品原料双酚A(bisphenolA,BPA)是酚类环境雌激素的主要代表。以BPA单体形式聚合成的聚碳酸酯、环氧树脂等多种高分子材料是制造包括婴儿奶瓶、水瓶、其他食品和饮料容器等的关键原料。BPA单体可在酸、碱或高温环境下释放出来。随着工业化社会的发展，BPA的使用量越来越大。近年BPA的日常暴露剂量急速上升，目前人们每日接触的BPA大约在1-2μg/kg水平（环境暴露剂量）。流行病学研究资料显示，可在受检对象血液、尿液、组织液中检测到BPA。BPA对人类健康的影响受到研究者们的广泛关注。新近国内外一系列研究证实新生儿期或围生期接触环境剂量BPA能引起雄性动物发生雌化、性早熟和生殖缺陷。但是，有关青春前期接触环境剂量BPA影响雄鼠性发育的研究却非常少。下丘脑-垂体-性腺(hypothalamic-pituitary-gonadal, HPG)轴的激素对青春期性发育的启动和成熟有重要的调控作用。下丘脑促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone, GnRH)神经元的激活是HPG轴青春期启动的关键。最近的研究表明，GnRH神经元主要受到下丘脑弓状核(arcuate nucleus,ARC)kisspeptin神经元的直接调控。Kisspeptin与GnRH神经元的G蛋白偶联受体54(G protein-couple receptor54, GPR54)结合能调节GnRH的释放。在青春前期，kisspeptin表达的快速增加，提示ARC核kisspeptin神经元参与青春期的启动。ARC-kisspeptin神经元还同时表达神经激肽B(neurokin B, NKB)、强啡肽(dynorphin, Dyn)，故又被称为KNDy神经元。同时，KNDy神经元和GnRH神经元都有NKB受体和Dyn受体的表达。研究发现，KNDy神经元分泌的NKB和Dyn对KNDy神经元和GnRH神经元具有正向和负向的调控。此外，KNDy神经元是GnRH/LH脉冲式释放的起搏器，LH脉冲频率增快被认为是青春期启动的重要标志之一。KNDy神经元表达雌激素受体(estrogen receptor, ER)α亚型，介导雌激素对KNDy神经元的抑制性调节。但是，有关BPA对KNDy神经元、HPG轴青春期启动和发育的影响迄今仍未见报道。青春期睾丸的发育和成熟受到黄体生成素（luteinizing hormone, LH)、促卵泡生成素(follicle-stimulating hormone, FSH)和睾酮(testosterone, T)的调节。青春前期激素水平的微小变动都有可能影响睾丸生精细胞的有丝分裂和减数分裂的过程，引起睾丸发育和成熟的异常。早期的研究报道，环境雌激素BPA也可以直接改变睾丸激素的合成、分泌和代谢等。本课题将研究青春前期低剂量BPA暴露对雄鼠HPG轴发育和对睾丸发育的影响，并进一步探讨BPA影响睾丸发育的中枢神经-内分泌调节机制和外周靶细胞作用机制。研究目的：1.观察青春前期低剂量BPA暴露对雄鼠HPG轴发育的影响及其机制。2.探讨青春前期低剂量BPA暴露对睾丸发育的影响及其分子机制。第一部分研究青春前期低剂量BPA暴露对HPG轴发育的影响及其机制研究材料与方法1．动物模型制备：出生后(postnatal day, PND)21天的雄性SD大鼠给予连续14天低剂量BPA(2μg/kg/day)皮下注射（以下简称BPA大鼠）；雌激素（E2）（0.4μg/kg/day）皮下注射（以下简称E2大鼠），BPA(2μg/kg/day)+E2（0.4μg/kg/day）皮下注射。2．激素水平检测：用放射免疫法检测血清的T、LH、FSH水平，LH脉冲释放的频率和幅度。3．免疫组织染色：观察ARC核kisspeptin免疫反应阳性(kisspeptin+)细胞的数量，POA核GnRH免疫反应阳性（GnRH+）细胞的数量。4．实时定量PCR：检测ARC核Kiss1、NKB和Dyn mRNA，POA核GnRH mRNA水平。实验结果1.与对照组相比，PND35-BPA大鼠T的水平降低，而LH和FSH水平显著上升；PND35-E2大鼠的T、LH、FSH水平都明显降低；PND55-BPA大鼠T的水平降低，LH和FSH水平无变化。2.与对照组相比，PND35-BPA大鼠GnRH+细胞数量没有改变，但是GnRHmRNA水平明显增加；PND35-E2大鼠GnRH+细胞数量和GnRH mRNA水平都显著降低。3.与对照组相比，PND35-BPA大鼠kisspeptin+细胞数量，以及Kiss1、NKB和DynmRNA水平都明显增加；PND35-E2大鼠kisspeptin+细胞数量显著减少，Kiss1、NKB mRNA水平也相应降低。BPA与E2联合处理可以抑制E2大鼠的Kiss1、NKB mRNA水平降低。4.与对照组相比，PND35-BPA大鼠的LH脉冲频率加快，虽然脉冲幅度没有改变；PND35-E2大鼠的LH脉冲频率无明显改变，但是脉冲幅度降低。结论青春前期接触低剂量BPA能增强青春期KNDy-GnRH表达，促进LH和FSH的释放，但是抑制睾酮的产生。第二部分研究青春前期低剂量BPA暴露对睾丸发育的影响及其机制研究材料与方法1．睾丸组织学观察：检测PND35大鼠和PND55大鼠的体重、睾丸重量、睾丸脏器系数（睾丸重量/体重）、曲细精管直径以及生精上皮厚度。检测PND35大鼠睾丸变形期精子管腔率、I-VIII期管腔率、IX-XIV期管腔率、各级生精细胞数。检测PND55大鼠附睾精子数、各级生精细胞数。2.用TUNEL染色，检测PND35和PND55大鼠的睾丸曲细精管凋亡细胞指数。3．用实时定量PCR的方法，检测PND35和PND55大鼠睾丸Fas、FasL和caspase3mRNA水平。实验结果：1.与对照组相比，PND35-BPA大鼠体重增加，但是睾丸重量与睾丸脏器系数改变无显著差异；PND55-BPA大鼠体重、睾丸重量、睾丸脏器系数都没有明显改变。2.与对照组相比，PND35和PND55-BPA大鼠睾丸曲细精管直径及生精上皮细胞层厚度均明显减少。3.与对照组相比，PND35-BPA大鼠变形精子管腔率下降，精原细胞和圆形精子细胞数量明显减少，而精母细胞数量没有改变。与对照组相比，PND55-BPA大鼠附睾精子数明显下降，精母细胞及圆形精子细胞数量明显减少。4. PND35-BPA大鼠睾丸凋亡细胞显著增多，PND55-BPA大鼠凋亡细胞与对照组相比无明显改变。5. PND35-BPA大鼠睾丸组织Fas、FasL和caspase-3的mRNA水平增加，而PND55-BPA大鼠Fas、FasL和caspase-3的mRNA水平无显著改变。结论青春前期接触低剂量BPA激活Fas-FasL信号通路，能增加生精细胞凋亡；持久性睾酮的缺乏，抑制精母细胞的减数分裂，导致睾丸发育和成熟的障碍。