细胞质雄性不育是高等植物的一种重要生物学性状,其产生的机理极其复杂,至今尚未得到完全解析。前人研究成果表明能量代谢异常会影响花粉正常发育,导致细胞质雄性不育。丙酮酸脱氢酶系作为能量代谢中的关键酶,其活性及调节与花粉发育有关。作为线粒体中能量代谢的主要调节酶,丙酮酸脱氢酶磷酸酶PDP活性的改变会引起丙酮酸脱氢酶PDC活性调节稳态被打破,导致能量代谢途径异常。PDP可以利用磷酸水解酶特性解除PDC的磷酸化,恢复其催化活性。在本实验室前期对丙酮酸脱氢酶磷酸酶GhPDC-E1α、GhPDK和GhPDP基因克隆并进行生物信息学分析及转录水平上基因表达研究的基础上,本研究首先对棉花晋A细胞质雄性不育系小孢子不同发育时期的GhPDC-E1α、GhPDK和GhPDP酶活性进行测定,结合前期研究结果,初步分析了GhPDP对GhPDC-E1α活性的影响;构建棉花GhPDP基因的原核表达系统,并进行表达与纯化;从棉花晋A细胞质雄性不育系花蕾总蛋白中筛选与GhPDP具有相互作用的蛋白质,并对潜在的互作蛋白质基因进行克隆和互作关系的进一步验证。结果如下:1.对晋A不育系及其保持系小孢子发育过程中GhPDC-E1α、GhPDK和GhPDP酶活性进行测定。结果发现,在晋A不育系中,小孢子败育前时期GhPDC-E1α酶的活性低于保持系;小孢子败育时期GhPDK的酶活性显著低于保持系;GhPDP酶的活性在小孢子败育前和败育时期均显著低于保持系。研究表明晋A不育系中GhPDC-E1α活性高低并不与PDC-E1α蛋白表达量相一致,而是取决于其活性调节酶GhPDP的活性水平。2.采用Over-Lap PCR方法,构建了重组表达载体p ET-22b-GhPDP,通过单因素试验和正交试验对诱导温度、诱导时间、IPTG终浓度和OD600进行优化,并在E.coli Transetta（DE3）中表达并进行纯化获得了GhPDP蛋白质,其分子量为42 k D。3.采用His pull-down技术,从棉花晋A细胞质雄性不育系花蕾总蛋白中筛选出与GhPDP具有潜在相互作用的蛋白质,并进行质谱分析。以质谱鉴定结果中的肽段覆盖率、得分、肽段匹配数等为筛选标准,共找到8个可能与GhPDP蛋白相互作用的蛋白质。它们分别是V型质子ATP酶催化亚基A,伴侣蛋白CPN60-2,T复合蛋白1亚基α,乙醛脱氢酶家族2成员B4,V型质子ATP酶亚基B2,延长因子1α,天冬氨酸蛋白酶,V型质子ATP酶亚基C。这些候选蛋白质与蛋白质合成与降解、能量代谢和花粉生长发育相关。4.以棉花晋A细胞质雄性不育系为材料,进行潜在互作蛋白基因Gh VHA-B2的克隆。Gh VHA-B2基因ORF序列长度为1458 bp,编码486个氨基酸。采用Over-Lap PCR方法,构建了重组表达载体p GEX-4T-1-Gh VHA-B2,在E.coli Transetta（DE3）中表达并进行纯化,获得了Gh VHA-B2蛋白,其分子量为54 k D。5.采用Over-Lap PCR方法,构建了重组表达载体p GEX-4T-1-GhPDC-E1α、p GEX-4T-1-GhPDK,并在E.coli Transetta（DE3）中表达并进行纯化,得到了GhPDC-E1α、GhPDK蛋白,其分子量分别为43 k D和41 k D。6.采用GST pull-down技术,对GhPDC-E1α、GhPDK、Gh VHA-B2蛋白与GhPDP蛋白进行体外互作关系验证。初步确定GhPDC-E1α、GhPDK、Gh VHA-B2蛋白与GhPDP蛋白具有相互作用。这一研究结果表明GhPDP不仅参与GhPDC的调控,而且与V-ATPase酶亚基存在相互作用,共同调控花粉的发育。7.采用双酶切的方法,构建过表达载体p RI101-AN-GhPDP,利用花序侵染法,将过表达载体导入拟南芥,获得T3代转基因拟南芥株系。