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研究背景:Micro RNA(mi RNA)是一种核苷酸数目为20-24个的小RNA,mi RNA在细胞内可以产生多种不同的调节作用。Mi RNA是一种非编码的RNA,但是他可以通过调控编码基因来发挥类似编码的作用。一个mi RNA可靶向调控多个不同的基因,而多个mi RNA亦可直接作用于同一个靶基因。所以mi RNA可以产生较为复杂的作用机制甚至组成一个调控网络。近年来,mi RNA在肿瘤方面的作用已经得到证实,并且成为了一个研究热点,mi R-1258在多种肿瘤中的作用已经被验证,然而其在结直肠癌中的作用尚未被研究。研究方法:(1)通过mi RNA RT-PCR检测mi R-1258在60对结直肠癌组织和癌旁组织、5种结直肠癌细胞以及正常结肠上皮细胞中的表达量,接着研究mi R-1258的表达情况与病人临床信息(性别,年龄,肿瘤分期,T分期,淋巴结转移,远处转移,肿瘤大小)的关系。(2)分别构建敲低及过表达mi R-1258的细胞系,通过CCK-8、平板克隆、Ed U、裸鼠皮下成瘤实验研究mi R-1258对结直肠癌细胞增殖的影响,并检测mi R-1258对结直肠癌细胞的细胞周期的影响。(3)通过生物信息学预测mi R-1258的下游靶点,并通过q RT-PCR、western blot、免疫组化染色、RIP(RNA immunoprecipitation)、双荧光素酶报告基因以及拯救实验验证。(4)q RT-PCR及western blot探究mi R-1258对细胞周期的部分关键因子表达的影响。研究结果:(1)与癌旁组织及正常肠上皮细胞系相对比,mi R-1258在结直肠癌组织及5种结直肠癌细胞系中的表达量显著降低,并且mi R-1258的表达量与病人肿瘤大小相关。(2)在体内及体外实验中,过表达的mi R-1258抑制结直肠癌细胞系的增殖,敲低的mi R-1258促进结直肠癌细胞系增殖。在体外实验中,过表达的mi R-1258将结直肠癌细胞系细胞周期阻滞在G0-G1期,敲低的mi R-1258使结直肠癌细胞系细胞周期S期比重变高。(3)生物信息学分析预测E2F8(E2F transcription factor 8)为mi R-1258的下游靶基因,并且E2F8的表达情况与mi R-1258呈负相关。与癌旁组织及正常肠上皮细胞系相比,E2F8在结直肠癌组织及5种结直肠癌细胞系中表达量升高,RIP证明mi R-1258可以与E2F8及AGO2(Argonaute2)蛋白结合,双荧光素酶报告基因实验验证mi R-1258可以与E2F8的3’UTR区结合,拯救实验结果说明E2F8可以回复mi R-1258对于结直肠癌细胞系增殖及细胞周期的影响。(4)mi R-1258可以影响细胞周期关键蛋白CCND1及p21的表达。研究结论:(1)mi R-1258在结直肠癌组织及结直肠癌细胞系中呈低表达。(2)mi R-1258抑制结直肠癌细胞的增殖并在G0-G1期阻滞其细胞周期。(3)mi R-1258靶向调控下游靶点E2F8。(4)mi R-1258通过调控下游靶点E2F8,进一步调控CCND1及p21的表达。(5)mi R-1258抑制结直肠癌细胞在裸鼠体内成瘤能力。