第1部分多囊卵巢综合征患者卵巢颗粒细胞长链非编码RNA的高通量测序表达谱研究背景:多囊卵巢综合征（Polycystic Ovary Syndrome,PCOS）属于育龄期女性中常见的生殖内分泌疾病之一。在我国,PCOS在19-45岁的汉族女性中的发病率已经高达5.6%左右。PCOS的临床表现具有显著的异质性,主要表现为卵巢多囊样改变、高雄激素血症与排卵功能障碍,常伴有胰岛素抵抗、糖尿病、肥胖等代谢异常类疾病,同时会增加心血管疾病和子宫内膜癌变等远期并发症的可能性。现在研究认为,引起PCOS的病因非常复杂,主要包括遗传因素、环境因素以及多种因素的相互影响等,但是具体病因与详细致病机制尚未明确。目前,具有编码蛋白质功能的区域是PCOS病因的研究的重点方向,但是对于非编码RNA在PCOS的发病机制中发挥的作用研究相对较少。非编码 RNA 主要包括长链非编码 RNA（lncRNA）,miroRNA,snRNA,snoRNA,piRNA,siRNA,它们通过直接或间接的调控方式调节基因或蛋白的表达在细胞或组织中发挥着作用,其中,lncRNA在细胞或组织中表达量较低,其长度超过200nt,它们的调控方式主要包括表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等,影响着细胞的增殖、凋亡、分化,并且在多种疾病的发生发展过程中发挥了重要的作用。到目前为止,lncRNA在PCOS的发病机制中发挥的作用仍不完全清楚。研究目的:本研究旨在通过对PCOS患者与对照组患者的卵巢颗粒细胞进行lncRNA与信使RNA（mRNA）高通量测序检测,观察lncRNA与mRNA在PCOS患者的卵巢颗粒细胞中的表达谱。研究方法:本研究共纳入6名PCOS患者与6名对照组患者,在取卵日收取卵泡液并在最短的时间内提取卵巢颗粒细胞。在提取卵巢颗粒细胞的总RNA后进行了高通量测序,用于检测两组中差异表达的lncRNA与信使RNA（mRNA）。经过对高通量测序结果的初步筛选后,每组使用30例卵巢颗粒细胞样本对测序结果进行扩大样本量的实时定量PCR（qRT-PCR）的验证。结果:通过高通量测序技术的检测,共有1049个差异表达的lncRNA以及3246个差异表达的mRNA。通过qRT-PCR的验证,发现7个lncRNA（NONHSAT101926.2、NONHSAT136825.2、NONHSAT227177.1、NONHSAT010538.2、NONHSAT191377.1、NONHSAT230904.1、ENST00000607307）和 3 个 mRNA（YAP1、ENTPD6 和 EREG）的表达与测序结果一致。经过相关性分析,发现7个lncRNA与激素水平以及卵泡计数相关,3个mRNA与脂质代谢相关。经过受试者工作特征曲线分析,发现7个lncRNA对区分PCOS患者与对照组有一定的价值。此外,NONHSAT230904.1 与NONHSAT227177.1在区分优质胚胎数量是否超过总胚胎数的50%方面具有一定价值。结论:我们的研究表明卵巢颗粒细胞的lncRNA和mRNA可能参与了 PCOS的发生和发展,这对于研究PCOS的病因与发病机制有一定意义。第2部分 卵巢颗粒细胞中LncRNANONHSAT227177.1高表达在多囊卵巢综合征中的作用与机制研究研究背景:多囊卵巢综合征（PCOS）是最常见的生殖内分泌紊乱的疾病之一,对越来越多的育龄期女性产生了重要的影响。育龄期女性的卵巢对于卵母细胞发育以及激素分泌具有重要作用。卵巢颗粒细胞是卵巢中重要的组成部分,其增殖与凋亡的动态平衡对于卵泡的发育具有关键的作用。PCOS患者卵巢的主要特征之一是在卵泡发育过程中会出现大量卵泡发育停滞,发生卵泡闭锁。研究表明,与未患PCOS的不孕症患者的卵巢颗粒细胞相比,PCOS患者的卵巢颗粒细胞有倾向于凋亡的趋势,并且在PCOS患者的卵巢颗粒细胞中的促凋亡因子与抗凋亡因子的比例显著不平衡。在人类基因组中,大存在众多的非编码RNA,其中长链非编码RNA（lncRNA）已经被证明在多种疾病发生中发挥了调控作用。许多研究已经证明,lncRNA通过调控细胞的增殖与凋亡等细胞功能参与了多种女性生殖疾病,如早发性卵巢功能不全（POI）、子宫内膜异位症等。但是lncRNA在PCOS的病因或发病机制中的作用还不清楚。研究目的:基于上一部分研究,通过研究PCOS患者卵巢颗粒细胞中差异表达的lncRNA NONHSAT227177.1的作用,阐明其在PCOS中发挥的作用与可能的作用机制。研究方法:通过第1部分的结果,我们获得了 NONHSAT227177.1在PCOS患者组中表达显著上调的结果,然后我们将NONHSAT227177.1的相对表达量与患者临床基本特征进行了相关性分析。在细胞功能实验方面,使用了卵巢颗粒细胞来源的KGN细胞系,发现NONHSAT227177.1对KGN细胞的凋亡能力有显著影响,并利用双荧光素酶报告基因实验（Luciferase Assay）以及RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）等实验技术进行分子机制研究。结果:通过对初步筛选的lncRNA进行扩大样本量验证后发现NONHSAT227177.1在PCOS患者组中的表达显著上调。相关性分析显示NONHSAT227177.1与基础FSH、基础LH呈正相关关系。细胞功能研究发现NONHSAT227177.1能够使卵巢颗粒细胞凋亡增多,阻滞于细胞周期G1/S期,并且能够与CHTOP（FOP）相互作用,并且通过调节启动子区域降低CHTOP（FOP）表达,从而影响雌激素受体α（ERα）的表达,最终引起卵泡成熟与排卵障碍以及血液循环中LH水平显著升高,最终参与PCOS的发生发展。结论:LncRNA NONHSAT227177.1能够促进卵巢颗粒细胞凋亡,阻滞细胞周期过程,并且能够抑制CHTOP（FOP）的表达,影响ERα的表达,进而影响卵泡成熟与正常排卵功能,引起了 PCOS的发生。第3部分卵巢颗粒细胞中LncRNAENST00000607307高表达在多囊卵巢综合征中的作用与机制研究研究背景:卵巢颗粒细胞对于卵泡发育是至关重要的,在多囊卵巢综合征（PCOS）的病因与发病机制中发挥的作用越来越受到关注。研究表明,PCOS患者的卵巢颗粒细胞具有易凋亡趋势,从而影响卵巢颗粒细胞功能,引起疾病的发生。在维持卵巢颗粒细胞正常功能过程中,线粒体的作用也是非常重要的。线粒体在细胞代谢过程中发挥着重要作用,并且参与了细胞增殖的信号转导过程。线粒体还可以释放活性氧（ROS）,ROS对细胞的增殖、代谢、基因表达和免疫反应具有重要的影响。有研究表明,长链非编码RNA（lncRNA）可以通过影响线粒体的正常功能参与疾病的发生,并且lncRNA也可以通过影响线粒体功能介导细胞凋亡。但是,lncRNA通过影响线粒体的正常功能参与PCOS的发生发展的具体调控方式尚不清楚。研究目的:在第一部分的研究结果基础之上,通过研究差异表达的lncRNA ENST00000607307的功能,阐明其在PCOS发生发展过程中的作用。研究方法:第1部分的结果显示,ENST00000607307在PCOS患者组中表达具有上调的趋势,因此我们对ENST00000607307继续扩大样本量验证,然后我们将ENST00000607307表达量与患者临床基本特征进行了相关性分析。在功能实验中,在卵巢颗粒细胞来源的KGN细胞系中发现ENST00000607307对细胞凋亡能力有显著影响,并利用双荧光素酶报告基因实验（Luciferase Assay）技术进行后续的分子机制研究。结果:通过继续扩大样本量验证后发现ENST00000607307在PCOS患者组中的表达显著上调。相关性分析显示ENST00000607307与扳机日子宫内膜厚度呈显著正相关关系,与白蛋白/球蛋白之比呈显著负相关关系,可能参与了代谢过程。细胞功能研究发现ENST00000607307能够增加MRPL20的表达,使卵巢颗粒细胞凋亡增多,阻滞于细胞周期G1/S期,最终可能引起PCOS的发生发展。结论:在PCOS患者组中高表达的ENST00000607307能够通过增加MRPL20的表达使卵巢颗粒细胞凋亡增加,导致了 PCOS的发生发展。第4部分接受体外受精-胚胎移植的胰岛素抵抗患者的卵巢敏感性显著下降研究背景:胰岛素抵抗（IR）是指体内靶组织对胰岛素刺激受损的生物学反应,主要包括肝脏、肌肉和脂肪组织。一般认为稳态模型胰岛素抵抗指数HOMA-IR≥2.57即为胰岛素抵抗。胰岛素抵抗可能会引起肥胖、心血管疾病以及非酒精性脂肪肝等代谢性疾病,同时也可能引起多囊卵巢综合征（PCOS）等生殖内分泌疾病。对于接受辅助生殖治疗的PCOS患者,除了克罗米芬、来曲唑等药物的经典促排卵治疗方法外,体外受精-胚胎移植（IVF-ET）技术也是常用的治疗不孕症的有效方式。在IVF-ET治疗过程中,卵巢对外源性促性腺激素（Gn）的敏感性对于卵泡发育以及妊娠结局具有重要作用。因此,根据患者的具体情况制定合适的Gn剂量,对于患者的促排卵治疗结果以及治疗安全具有重要意义。卵巢敏感性指数（OSI）是通过获卵总数以及Gn总剂量计算得到的,能够反应每个卵泡对于Gn剂量的需求。有研究表明,胰岛素抵抗不仅会损害胚胎的早期发育,还会降低IVF-ET中胚胎的植入率,但胰岛素抵抗对于卵巢敏感性的影响至今尚不清楚。研究目的:本研究旨在观察OSI与传统卵巢反应预测指标以及IR的关系,并阐明胰岛素抵抗对于卵巢敏感性以及妊娠结局的影响。研究方法:我们收集了入组患者的临床基本特征以及IVF-ET治疗过程中的详细情况,将患者分别分为 PCOS 组、Control 组、PCOS-IR 组、Control-IR 组、IR 组、Non-IR组,比较了各组中OSI水平。我们还将OSI与患者临床指标进行了相关性分析,同时分析了 OSI在IR患者妊娠结局以及控制性促排卵方案的选择中的作用。OSI的计算公式为:获卵总数/外源性促性腺激素总剂量*1000。结果:我们发现OSI在IR组显著下降,并且OSI与抗缪勒管激素（AMH）、窦卵泡计数（AFC）、基础LH/FSH 比值、扳机日卵泡计数、扳机日优势卵泡数、获卵数、胚胎数以及优质胚胎数呈显著正相关关系,OSI与年龄、BMI、基础FSH水平、Gn的启动剂量、Gn的总剂量呈显著负相关关系。此外,阳性生化妊娠患者与阳性临床妊娠患者中的OSI值显著增高。与GnRH拮抗剂方案相比,IR患者通过标准长方案的促排卵治疗可以获得更高的优势卵泡率（扳机日优势卵泡计数/扳机日卵泡总数）。结论:IR患者的卵巢敏感性显着降低,OSI与传统的卵巢反应标志物具有显著相关性,并且可能是胰岛素抵抗患者生化妊娠和临床妊娠阳性率以及控制性促排卵方案较好的预测指标。