【摘 要】
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兽用疫苗的使用有效降低了重大动物疫病的发生,对畜牧养殖业的健康发展具有重要意义。选择合适的佐剂对于提高兽用疫苗的免疫保护效果事半功倍。油乳佐剂,特别是水包油型油乳佐剂,由于黏度低、毒性低,已成为近年来兽用疫苗制造行业研究的重点。然而,传统的水包油型油乳佐剂制备过程受到乳化设备、转子速度、乳化时间等限制,导致生产成本过高,难以满足兽用疫苗的生产需求。自乳化型水包油乳剂主要是基于含有油相、表面活性剂和
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兽用疫苗的使用有效降低了重大动物疫病的发生,对畜牧养殖业的健康发展具有重要意义。选择合适的佐剂对于提高兽用疫苗的免疫保护效果事半功倍。油乳佐剂,特别是水包油型油乳佐剂,由于黏度低、毒性低,已成为近年来兽用疫苗制造行业研究的重点。然而,传统的水包油型油乳佐剂制备过程受到乳化设备、转子速度、乳化时间等限制,导致生产成本过高,难以满足兽用疫苗的生产需求。自乳化型水包油乳剂主要是基于含有油相、表面活性剂和辅助表面活性剂的自乳化系统,通过简单混合、搅拌即可完成。目前,自乳化制备的乳剂主要用于递送抗肿瘤、抗病毒、抗菌等口服药物,而在疫苗中使用报道较少。本研究提出一种通过将油相、表面活性剂和助表面活性剂简单混合的方式制备水包油佐剂,通过筛选各组分物质,优化组分剂量,确定自乳化水包油纳米佐剂的配方（X2-17）,配合口蹄疫灭活抗原混制成疫苗。探索拟制备X2-17的理化特性与刺激动物免疫应答水平之间的关系;以小鼠为动物模型,通过监测其免疫效力（抗体持续期、免疫水平及抗体亚型）,同时观察其临床指标及病理切片了解其安全性;最后通过对细胞因子、淋巴结树突细胞（DCs）活化及脾淋巴细胞的分化研究,初步探讨X2-17的免疫机制,为X2-17的应用提供理论依据。本研究主要分为两部分:（1）自乳化型水包油纳米佐剂的配方设计及表征本实验旨在筛选出一种稳定的自乳化水包油配方。考虑其多组分体系,分选合适的油相、表面活性剂和助表面活性剂,调节其不同组分的质量比,结合自乳化能力测试、伪三元相图以及稳定性考察中设计出X2-17配方（角鲨烯:聚氧乙烯月桂醚:二甘醇单乙醚=0.3:0.5:0.2）,并对其进行理化表征。通过粒径分析仪检测出粒径为25.16±0.21 nm、电位为-2.81±0.17 m V和多分散系数为0.057±0.023,表明其粒径分布均匀且组分稳定。将X2-17放置在37℃恒温培养箱中,不断监测第1天、14天、28天、60天的结构、粒径、电位等变化,发现乳剂未出现分层、破乳或浑浊现象,粒径等显著变化,表明配方X2-17具有良好的稳定性。透射电镜观察发现水包油液滴分散呈类球型,粒径在20-30 nm之间,与粒径分析仪结果保持一致。考察X2-17自乳化能力与稀释倍数之间的关系,发现在1:3、1:4、1:9比例稀释时,配方稳定性强且可稀释。对小鼠注射一定剂量的X2-17,7天内小鼠饮食正常,被毛柔顺,精神正常,注射部位未出现红肿、炎症或脱毛等不良现象,进一步通过组织病理切片检测,发现各重要器官或组织未出现炎性细胞浸润等病理损伤,表现出该配方良好的生物安全性。由此表明,配方X2-17可通过自乳化制备出粒径均一、稳定的纳米乳,且对动物机体具有良好的耐受性,为后续配合兽用疫苗应用提供了试验依据。（2）自乳化水包油纳米佐剂的免疫增强效力评价及机制研究本实验旨在评价配方X2-17的免疫效力并探索其可能的免疫增强机制。将口蹄疫灭活抗原与配方X2-17混合制备疫苗,对小鼠进行皮下免疫,检测小鼠血清中口蹄疫特异性抗体及亚型,并监测抗体持续期。结果发现X2-17+FMDV免疫组小鼠在免疫后12周内,血清中口蹄疫特异性抗体水平显著高于单独FMDV免疫组（p＜0.05）,但与商品化ISA206+FMDV免疫组的抗体水平无显著差异（p＞0.05）。对免疫后小鼠血清的FMDV抗体亚型进行分析,发现X2-17+FMDV免疫组显著促进了Ig G2a的产生;与单独FMDV免疫组相比,Ig G2a/Ig G1比值显著提高（p＜0.05）,Ig G2a/Ig G1值升高的表明X2-17更有利于促进Th1免疫应答;此外,对不同试验组小鼠的淋巴结DCs进行流式细胞仪检测,发现单独FMDV免疫组相比,X2-17+FMDV免疫组的CD80+CD11c+、CD86+CD11c+、MHC-Ⅱ+CD11c+细胞比例升高,但各组无显著性差异（p＞0.05）,表明X2-17可能有助于DCs的成熟,进而有利于抗原提呈;X2-17+FMDV组能显著促进脾T细胞向CD4+细胞分化,但与商用ISA206无显著性差异（p＞0.05）;X2-17+FMDV免疫组刺激小鼠分泌的IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ水平显著高于单独FMDV免疫组（p（27）0.05）,与商品化的ISA206结果无显著性差异。本研究结果证实X2-17可以显著提高机体对FMDV的免疫应答,并显示出与ISA206相当的免疫增强效果,为未来新型动物疫苗产品的研发提供了实验数据支撑。
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