【摘 要】
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目的:皮肤是人体最大的器官,很容易受到各种损伤,在过去的几十年里,伤口敷料、同种异体移植、组织工程替代品等治疗手段的出现促进了皮肤损伤的修复,然而创面血管生成不足、发病率高、粘附性低和制造成本高等问题极大地限制了这些治疗策略的应用。而细胞疗法为皮肤再生和修复提供了一种新的治疗手段。间充质干细胞是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞,是目前临床应用研究较多的一类干细胞,通过多向分化与旁分泌
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目的:皮肤是人体最大的器官,很容易受到各种损伤,在过去的几十年里,伤口敷料、同种异体移植、组织工程替代品等治疗手段的出现促进了皮肤损伤的修复,然而创面血管生成不足、发病率高、粘附性低和制造成本高等问题极大地限制了这些治疗策略的应用。而细胞疗法为皮肤再生和修复提供了一种新的治疗手段。间充质干细胞是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞,是目前临床应用研究较多的一类干细胞,通过多向分化与旁分泌作用发挥组织再生与损伤保护作用。但细胞疗法存在一个显著缺点,注射的细胞倾向于扩散到预定部位以外的组织。而微胶囊技术是一种很有吸引力的运送细胞或生物活性分子的方法,可以为细胞提供保护壳,并作为生长因子的控释放系统。构建的海藻酸钠（ALG）复合纤维蛋白（Fibrin）微囊可以很容易地注射到组织中,并具有最小的侵入性,并均匀分布在注射区域。作为一种物理屏障,微囊使干细胞避免皮肤损伤部位恶劣环境的影响,也并不改变干细胞的生物特性,可正常发挥损伤修复作用。方法:分离纯化和增殖培养脐带间充质干细胞（UMSCs）,进行免疫表型和多向诱导分化鉴定,以证明其干细胞属性;使用静电喷雾法制备了一种UMSCs-ALG-Fibrin微囊,使干细胞在其内部生长增殖,注射于体内研究了微囊联合UMSCs对小鼠皮肤缺损创面的修复效应和机制。结果:采用贴壁法分离得到UMSCs,选用10%HPL的DMEM培养液进行原代培养,再选用4%HPL扩增培养液进行一般传代,得到代脐带间充质干细胞,并通过免疫表型和多向诱导分化鉴定其为干细胞属性。后用静电喷雾法制备了UMSCs-ALG-Fibrin微囊,选取合适的各实验因素水平,进行（）正交实验,以及包封细胞浓度的因素实验,最终得出微囊制备过程中最优的工艺参数:海藻酸钠浓度为1.2%,应用电压为16 KV,注射液的推进速度20 m L/h,针头距固化液液面的高度6 cm,最佳包封浓度为1.0×个/m L。采用上述最优工艺参数制备得到的UMSCs-ALG-Fibrin微囊,倒置相差显微镜和扫描电子显微镜观察到微囊内部结构为疏松多孔结构。在微囊释放脐带间充质干细胞实验中,最终得出微囊裂解过程中的最优液化条件:液化温度为37℃,液化时间为10 min柠檬酸钠溶液加入量与海藻酸钠溶液比值为2:1。又在细胞水平评价UMSCs-ALG-Fibrin微囊的安全性和有效性,Live/Dead细胞染色和CCK-8法证实了脐带间充质干细胞可以在微囊内部生长增殖。其次验证了微囊内的UMSCs的免疫表型、三系分化的生物特性和q PCR检测微囊中UMSCs的VEGF的基因表达情况都并未改变。最后构建皮肤损伤小鼠模型,对正常组、ALG-Fibrin微囊组、UMSCs-ALG-Fibrin微囊组和UMSCs组分别对应给药探究对皮肤损伤的治疗效果。通过直观的观察创面愈合情况以及创面区域病理学切片染色来比较各实验组的修复效果,因UMSCs-ALG-Fibrin微囊为UMSCs提供了良好的微环境且在皮肤损伤治疗中发挥了较优的疗效。结论:贴壁法分离培养得到UMSCs,并通过藻酸盐微囊化技术制备得到包载UMSCs的ALG-Fibrin微囊,干细胞在微囊内部其最重要的生物学特性没有改变,也并未分化为其他细胞,同时也不影响干细胞分泌释放因子的旁分泌功能,为体内治疗皮肤损伤的研究提供基础。后经皮下注射于皮肤损伤小鼠模型,实现了体内细胞留存效率高,为干细胞提供保护壳,并作为生长因子的受控释放系统提供了新思路和新途径。
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